一种与甘蓝型油菜含油量qtl紧密连锁的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于油菜分子标记制备技术领域，具体设及一种与甘蓝型油菜含油量QTL 紧密连锁的分子标记，该分子标记或其组合可用于甘蓝型油菜含油量性状改良中的标记辅 助选择W及在含油量性状位点精细定位和图位克隆中应用。
【背景技术】
[0002] 油菜作为世界上最重要的油料作物之一，每年能够产生大约两千六百万吨的植物 油，约占植物油生产总量的15%。油菜生产W收获油菜巧后棒成油为主要目的，提高其产油 量是油菜生产的最终目标。油菜产油量取决于两个因素:菜巧产量及菜巧含油量。与过去几 十年中产量的较快速度增长相比，我国油菜新品种含油量却提高较少。因此，通过提高菜巧 含油量来实现产油量的提高是油菜育种的主要目标。虽然Ξ酷甘油(油脂的主要储存形式） 的合成途径已经很清楚，但是对于油料作物，包括油菜含油量变异的遗传及分子机制，我们 仍缺乏深入的了解。
[0003] 关于含油量的遗传研究，前人已经定位到很多相关的QTUQuantitative Trait Loci)。由于群体材料、群体种植环境等各不相同，所W定位的QTL也存在差异。Delourme等 (2006)利用两个Double化ploid(DH)群体定位了24个和含油量有关的QTLs，分别可解释表 型变异的4.6 %-14.3%，只有一个QTL在两群体A3连锁群上能同时检测到。Wang等(2013)利 用含油量差异极大的两个材料构建的DH群体在8个环境中定位到24个与含油量有关的 Q化S，分别可解释表型变异的3.6%-11.7% ;通过整合前人定位的含油量QTLs，发现存在47 个QTLs与含油量有关。另外Jiang等(2014)利用TN DH群体在15个环境中定位了41个和含 油量有关的QTLs，分别可解释表型变异的1.6%-24.5% ;通过整合前人定位的含油量QTLs， 发现存在46个QTLs与含油量有关。
[0004] 综上所述，油菜含油量是由多基因控制的复杂数量性状，表现出环境和材料特异 性。在油菜中至少存在46个控制含油量的QTLs,运些QTLs遍布在甘蓝型油菜的19条染色体 上。通过不同连锁群体的QTL定位，发掘新的控制含油量的QTLs对于解析含油量的遗传变异 是十分必要。在此基础上开发紧密连锁的分子标记能加速油菜含油量性状的改良进程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是发掘油菜含油量新的QTL及开发紧密连锁的共显性分子标记，并 将其用于油菜高含油量性状的选育。运些分子标记可应用于甘蓝型油菜含油量性状改良中 的分子标记辅助选择W及在含油量性状QTL精细定位和图位克隆中的应用，从而加速油菜 含油量性状的改良进程，提高油菜育种的准确性和选择效率。
[0006] 本发明是通过W下方案实现的。
[0007] a) W甘蓝型油菜品种中双11号（中国农业部主管，全国农作物品种审定委员会审 定，国审油2008030;2013年测定的含油量为51.4%)与低含油量品系甲4254(2013年测定的 含油量45.3%，该材料的来源参见：中国发明专利授权;专利权人:华中农业大学;专利号化 2009102734352;发明名称：甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用；公开号 CN101824472A;公开日 2010.09.08)杂交，得到 F1;
[0008] b)由杂种F1的花蕾通过小抱子培养获得分离的DH系群体；
[0009] C)对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，并对每个株系的基因型进行描 述;具体方法:分离DH群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR(简单序列重复）、InDel(插入 缺失)和SNP(单核巧酸多态性）引物进行PCR扩增，获得每个株系的基因型；
[0010] d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记信息构建甘蓝型 油菜遗传连锁图。遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3. (KLincoln等，1992)软件进行；
[001 U e)现憶畑群体每个系成熟种子的含油量数值；
[0012] f)将DH群体每个株系的含油量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁 和QTL分析，Q化检测采用MapQ化6(Van Ooijen 2009)软件中的MQM作图法进行，W2.5为 L0D阔值，大于2.5说明存在一个QTL位点。
[0013] g)在A5连锁群上存在一个新的QTL位点，SNP标记0ilA5-A和0ilA5-G处于QTL峰值 处。运2个分子标记或其组合可作为与A5含油量QTL紧密连锁的分子标记。
[0014] 在上述方法中，所用SNP引物对的核巧酸序列如下所示：
[001引引物对0ilA5-A(在序列表中的命名分别为沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2):
[0016] 正向引物5 ' -ATGCGAAGTGTAAAGAAGATTATGAA-3 '，即，SEQ ID NO: 1，
[0017] 反向引物5'-TACGCTTCAGTCTTCACGAATCAC-3'。即，沈Q ID N0:2;
[001引引物对0ilA5-G(在序列表中的命名分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4):
[0019] 正向引物5'-CGTGGAAGTTATGCGTCTTCTTATTC-3'，即，沈Q ID N0:3，
[0020] 反向引物5'-GATGCAACAAGTTGTGCAGGTAACCA-3'。即，SEQ ID N0:4。
[0021] 其中，引物对0ilA5-A(即本发明的分子标记第一组)和0ilA5-G(即本发明的分子 标记第二组)分别用于扩增如序列表沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6所示核巧酸序列。运2对引 物的扩增产物可作为一对共显性分子标记0ilA5在油菜标记辅助选择中应用，能够区分(筛 选)甘蓝型油菜含油量A5新位点高含油量与低含油量材料。
[0022] 本发明筛选的两个分子标记既可W单独使用，也可W组合使用，使现有的含油量 性状筛选效率大大提高。
[0023] 本发明的积极效果：
[0024] 本发明成功得到与前人不同的油菜含油量新的QTL及其位点特异性标记。该QTL与 之前报道的QTLs相比，效应较大，可解释表型变异的20%，能提高1.8%的含油量，运用该 Q化位点特异性标记可鉴别含油量新QTL，从而可W克服传统育种中依靠表型进行选择的缺 点。利用本发明制备的分子标记可进行油菜含油量性状的分子标记辅助选择，可W明显减 少育种工作量，缩短育种年限，加快油菜育种的进程。
【附图说明】
[0025] 序列表中SEQ ID N0:1是本发明筛选的引物对0ilA5-A的正向引物序列；
[0026] 序列表中SEQ ID N0:2是是本发明筛选的引物对0ilA5-A的反向引物序列；
[0027] 序列表中SEQ ID N0:3是本发明筛选的引物对0ilA5-G的正向引物序列；
[002引序列表中SEQ ID N0:4是本发明筛选的引物对0ilA5-G的反向引物序列；
[0029] 序列表中SEQ ID N0:5是本发明筛选的引物对0ilA5-A扩增的分子标记的核巧酸 序列，序列长度为344bp;
[0030] 序列表中SEQ ID N0:6是本发明筛选的引物对0ilA5-G扩增的分子标记的核巧酸 序列，序列长度为348bp。
[0031 ]图1:是本发明的技术流程图。
[0032] 图2:是本发明引物对0ilA5-A和0ilA5-G在甘蓝型油菜高含油量品种中双11号和 低含油量品系甲A254的基因组DNA中的扩增结果。0ilA5-A和0ilA5-G引物对的PCR扩增产物 是在1%的琼脂糖凝胶上电泳分离的图片。
[00削图3:本发明DH群体A5连锁群上含油量QTL的定位结果。附图标记说明：图3中的A图 为QTL
[0034] 扫描的L0D值;图3中的B图为A5染色体的局部遗传连锁图，上排数字表示遗传距离 (cM)，
[0035] 下排为构建遗传连锁图所用的分子标记；图3中的C图为QTL的基本信息，图中R2: Q化能够解释的表型变异比例;其中A:加性效应;CI: QTL的置信区间。
[0036] 图4:是本发明筛选的分子标记的核巧酸序列，序列长度为348bp。其中在该序列的 第1-24位斜体加下划线的碱基是引物序列，在该序列的319-344位斜体加下划线的碱基是 引物序列。
[0037] 图5:是本发明筛选的分子标记的核巧酸序列，序列长度为344bp。其中在该序列的 第1-26位斜体加下划线的碱基是引物序列，在该序列的323-348位斜体加下划线的碱基是 引物序列。
【具体实施方式】 [003引实施例1
[0039] 1、甘蓝型油菜含油量定位群体的构建及田间试验
[0040] 在本实施例中，W甘蓝型油菜品种中双11号（中国农业部主管，全国农作物品种审 定委员会审定，文号：国审油2008030;2013年测定的含油量为51.4%)作母本，^低含油量 的甘蓝型油菜品系甲A254(2013年测定的含油量45.3%，该材料的来源参见：中国发明专利 授权;专利权人:华中农业大学;专利号化2009102734352;发明名称:甘蓝型油菜高油酸分 子标记及制备方法与应用；公开号CN101824472A;公开日2010.09.08)作父本杂交得到尸1， 利用F1植株的花粉经小抱子培养(小抱子培养方法参见文献，余凤群等，提高甘蓝型油菜小 抱子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997,23(2):165-168)得到由149个株 系组成的双单倍体(简称DH)群体。
[0041 ] 将上步所得的DH系和其亲本（中双11号，甲A254)于2012-2013种植在武汉华中农 业大学油菜试验田。田间试验采取完全随机区组设计，Ξ次重复，每一个系种二行，每行11-12个单株，株距平均24cm左右，行间距30畑1。2013年5月份从田间收割回成熟的试验材料，从 自由授粉的单株上脱下种子，清理掉杂质和不饱满的种子，至少放置4周W上，在空气中自 然干燥。含油量采用化SS NIRSystems