Hav病毒样颗粒的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种含有甲肝病毒HAV5’-UTR基因的病毒样颗粒的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]甲型肝炎病毒是1973年Feinslone首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中发现甲型肝炎病毒(Hapatitis A virus,HAV )。属微小RNA病毒科，新型肠道病毒72型，是一种常见的食源性疾病病毒，HAV对外界抵抗力较强，耐酸碱，室温下可生存I周，干粪中25°C能生存30天。人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，少数人表现为急性甲型肝炎，严重危害人民群众健康。甲肝病毒呈全世界分布，我国作为高发区之一，其发病率十分高。甲肝病毒主要通过食物传播，当人们生食含有甲肝病毒的食物时，极有可能因感染病毒而诱发甲型肝炎。美国曾经出现因食用冻草莓引起的甲肝暴发事件。因此，食品中甲肝病毒的快速检测对于保障公共卫生安全非常重要。
[0003]目前，食品中HAV检测的常用方法有RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术，为了保证检测的准确性，实验中必须设立阳性对照或质控品。通常使用病毒培养物或是由RNA逆转录得到的cDNA做标准品，但是前者存在生物安全的隐患且易被核糖核酸酶降解，后者不能体现核酸提取过程和反转录对试验的影响。本发明采用Armored RNA技术，构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。
[0005]本发明为解决上述技术问题，将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中，构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重组质粒。并通过RT-RCR技术扩增说￥基因，将其克隆于?冊-1^21118中，构建原核重组表达质粒pNH-MS2his-HAV。并将其转化于表达大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达。结果表明，表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs，而且其中含有HAV的基因RNA序列，并且该RNA序列具有良好的稳定性，可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于临床及样品检测。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
本发明设计了一组扩增HAV5 ’ -UTR基因引物，序列如下:
HAV-UTRfI:ATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTA；
HAV-UTRrI:AAGAATGAGGAAAAACCTAAATGCC；
5‘端和3’端分别加上Hind III和Not I酶切位点。
[0007]本发明提供一种pNH_MS2his重组质粒，pNH_MS2his重组质粒中插入的的HAV5’-UTR基因片段序列如下:
TCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTTCCCTTCCCTGTCCTTCCCCTATTTCCCCTTGTTTTGTT
TGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTTAATCTGTTTCTCTATAAGAACACTCAATTTTCACGCTTTCTG
TCTTCTTTCTTCCAGGGCTCTCCCCTTGCCCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGGGTCAACTCCATGATTAGCA
TGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGACGCAGATGTTTGGGACGTCGCCTTGCAGTGTTAACTTGGCTCTCATGAAC
CTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGAT
AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGGCTCTCATCCAGTG
GATGCATTGAGTGAATTGATTGTCAGGGCTGTCTCTAGGTTTAATCTCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACTA
TTTGGCCTTAAATGGGATCCTGTGAGAGGGGGTCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTG
TTTGCCTCTGAGGTACTCAGGGGCATTTAGGTTTTTCCTCATo
[0008]本发明还提供一种制备含有HAV5，-UTR基因的HAV病毒样颗粒标准物质的方法，包括下列步骤:
(I)含有组氨酸标签的VLPs重组质粒pET-NH-MS2his的构建
将pET32a质粒使用Xba I和Nco I消化，去除其中的Xba I和Nco I两个酶切位点间的序列，将人工合成的 5 ’ -P04-CTAGATTACAAGGC-3 ’ 和 5 ’ -P04-CATGGCCTTGTAAT-3 ’ 两条互补的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定；
采用一步法扩增试剂盒以MS2Pfl和MS2Prl为引物，以MS2 RNA为模板扩增MS2目的片段;扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的片段，用50yL ddH20洗脱，标记为MS2 DNA ；
采用OneStep RT-PCR，以得到的MS2 DNA为模板，分别用引物MS2Pfl和ms2hispr以及ms2hispf和MS2Prl扩增MS2上和MS2下2个DNA片段;扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后，存于4°C备用;再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pfl和MS2Prl为引物做PCR，得到引入了编码组氨酸标签序列的MS2 DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的PCR产物命名为MS2his;
分别将制备的pET-NH载体和回收的MS2his片段用限制性内切酶BamHI和Hind ΙΠ进行酶切消化;将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后与PET-NH载体用Solut1nI连接酶进行连接;连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取单菌落作进行酶切鉴定;从平板培养基上挑选单菌落接种至5 ml的含有Amp抗生素的液体培养基中，37°C振荡培养12-16小时，参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取；以提取的质粒为模板，以MS2Pf和MS2Pr为引物进行PCR扩增；将PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；若可见载体与I 700bp的MS2目的片段即为阳性。
[0009 ] (2)构建含有HAV5 ’ UTR的原核表达载体pNH_MS2h i s
按RNA提取试剂盒说明书的方法提取HAV总RNA为模版，以HAV-UTRfl和HAV-UTRrl为引物，扩增HAV5’-UTR蛋白基因，RT-PCR体系为:5 XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix IyL,Enzyme Mix lyL，引物NF和NR各lyL，RNA模板5yL，ddH20补足25 yL，反应条件为，50°C反转录30min，95°C灭火变性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C I min，40个循环，最后72°C延伸10 min ；扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见660bp条带，宝生物凝胶回收试剂盒回收HAV5’-UTR蛋白片段。
[0010] Hindm和NotI双酶切pNH-MS2his和HAV5’-UTR蛋白片段，胶回收试剂盒回收酶切的pNH-MS2his和HAV5 ’-UTR蛋白片段，回收产物16°C连接过夜;连接体系为载体pNH-MS2his和HAV-UTR蛋白片段分别为2 yL和6 yL，T4 DNA连接酶I yL，1XT4连接酶buffer I yL;连接产物转化DH5a感受态细胞，将涂板后获得的重组克隆进行PCR鉴定;将阳性克隆菌种送测序，鉴定为阳性的重组载体命名为pNH-MS2his-HAV5，-UTR ；
(3)诱导及纯化重组pNH-MS2his-HAV5’UTR质粒
将测序正确的pNH-MS2his-HAV5 ’-UTR质粒转化表达菌株BL21 (DE3)，将阳性克隆菌株接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D600=0.6，加入IPTG至终浓度为Immol/L，诱导表达6 h;离心收集菌体;菌体中加入裂解缓冲液重悬，于冰上放置30min，离心去除菌体碎片，将上清加入预装有N1-NTA的纯化柱中，使液体自然流出，加入3倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤2次，然后加入洗脱缓冲液将病毒样颗粒洗脱，命名为HAV5 ’ -UTR-VLPs。
[0011]为了检测HAV，针对HAV的UTR基因，本发明设计了一种鉴定引物和探针，序列如下: 正向引物 HAV-F: 5 ’ -TCACCGCCGTTYGCCTAG-3 ’
反向引物 HAV-R: 5，-GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3，
探针HAV-P: 5 ’ -FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-BHQ-3 ’。
[0012]本发明中涉及的MS2及其相应的引物都是本领域公知的，并且已经商业化的生物材料。
[0013]本发明的有益效果为:(I)高效便利:按照本发明方法能够高效、便利的得到含有HAV5’UTR-UTR片段病毒样颗