AaALDH1基因启动子及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，设及一种启动子及其应用，尤其设及一种在植物分泌 型腺毛中特异表达的转运蛋白基因启动子(proAaAL的Π )及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛属的一年生草本植物，从青葛中可W提取一 种倍半祗内醋类过氧化物一一青葛素，青葛素对治疗追疾效果显著，被世界卫生组织称做 是"世界上唯一有效的追疾治疗药物"。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗追疾的方 法就是青葛素联合疗法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)。植物青葛是 目前世界上唯一获取青葛素的天然资源，但其青葛素合成量极低，仅为干重的0.1-0.8%， 使得运种药物的大规模商业化生产受到了限制。
[0003] 在目前的青葛基因工程研究中，多采用组成型的启动子，例如烟草花叶病毒35S启 动子(CaMV35)。运种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，可能会对植物 的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行 遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可W克服组成型启动子的种种弊端，因此，克 隆得到青葛分泌型腺毛特异性的启动子对青葛素代谢工程具有较为重要的意义。
[0004] AaALDHI (青葛醒还原酶基因）编码青葛素合成途径下游的一个关键酶，可W催化 青葛素前体青葛醒和二氨青葛醒的氧化反应。AaALDHI在叶片发育初期及不同组织部位中 的表达谱与青葛素合成途径中分泌型腺毛特异性表达的基因 ADS、CYP71AV1和DBR2均具有 较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在分泌型腺毛中特异性表达。
[000引因此，本发明致力于开发一种植物腺毛组织特异表达的启动子，尤其是一种 AaALDHI启动子。
【发明内容】
[0006] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种使基因在植 物分泌型腺毛中特异性表达的启动子，尤其是使AaALDHI基因在植物分泌型腺毛中特异高 效表达的启动子，从而为研究AaALDHI基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠 定基础，也对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
[0007] 为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种启动子，该启动子是能调控基因在 分泌型腺毛中特异表达，其核巧酸序列如SEQ ID No: 1所示。该启动子为特异型启动子。
[0008] 进一步地，该启动子是青葛AaAL的Π 基因上游的启动子。
[0009] 进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、GARE-motif、 AE-b ο X、GA-mo t i f、ARE、H沈和 TCCC-motif。
[0010] 本发明的另一方面提供上述启动子的应用，是在利用植物分泌型腺毛组织表达和 生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
[0011] 进一步地，其中代谢产物为青葛素。
[0012] 本发明的又一方面提供一种载体，该载体连接有如上所述的启动子。该载体可W 是 pCAMBIA1391z 载体。
[0013] 本发明的再一方面，提供一种制备高产青葛素的转基因青葛的方法，包括W下步 骤：
[0014] 步骤一、根据青葛基因组中AaALDHl基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如上所述 的启动子的序列；
[0015] 步骤二、将步骤一中获得的AaALD化基因的启动子的序列连入PCAMBIA1391Z载体， 获得 pCAMB IA1391 Z-proAaALDHl 载体；
[0016 ] 步骤立、将步骤二中获得的pCAMBIAl 391 Z-proAaAL畑1载体转化根癌农杆菌；
[0017] 步骤四、将步骤Ξ中获得的带有pCAMBIA1391Z-proAaAL的Π 载体的根癌农杆菌转 化青葛，并进行检测；
[0018] 步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位。
[0019] 优选地，其中启动子与青葛素合成途径中的关键酶基因融合，从而加强青葛合成 途径，最终提高青葛素的合成。该青葛素合成途径中的关键酶基因可W是AaALD化基因等。
[0020] 优选地，其中巢式PCR的引物序列为：
[0021 ]第一轮PCR:proALDHl-FPl: 5 '-TGGCTTGCTGTTCAAAGAAGGCTAA-3 ' ；
[0022] proALDHl-RPl: 5 '-GCCTTMCGGCCAAATCAATGTCTT-3 ' ；
[0023] 第二轮口(：1':口'〇40)化斗口2:5'-17666(：了41'170：1'1'(：174666(：1^6(：-3'；
[0024] proALDHl-RP2:5 '-GTTGCTAACACTTCTTCTGTCGCTGGAT-3 '；
[00巧]优选地，为构建pCAMBIA1391z-proAaALDHl载体，在proAaALDHl两端分别引入了 HindllI的酶切位点和Bam HI的酶切位点，使用的引物序为：
[0026] 1391Z-proAaALDHl-FP:5 '-CCCAAGCTTATGAACCATTAGAAG-3 '
[0027] 1391Z-proAaALDHl-RP:5'-CGCGGATCCCTTTGTTTTTTATGA-3'。
[0028] 本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括如前所述的启动子。优选地，该表达盒 为proAaALDHl-GUS表达盒，在该表达盒中，可W插入青葛素合成途径中的关键酶基因，也可 W插入想要在分泌型腺毛中表达的基因。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明利用有效的青葛表皮毛组织特异 性启动子代替组成型启动子，可W通过分子生物学的方法构建在青葛分泌型腺毛特异表达 目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基 因的定向操作W获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用 植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。另外，克隆proAaALDHl启动子将为 研究AaALD化基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。
[0030] W下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，W 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明的一个较佳实施例的转基因青葛植株的PCR检测结果图。其中，M:分 子量标记；泳道1:阳性对照；泳道2:阴性对照；泳道3和4、5和6、7和8、9和10 W及11和12:分 别是5株转基因青葛植株基因组为模版，进行的两次单独的PCR得到的产物。
[0032] 图2是本发明的一个较佳实施例利用AaALDHl基因启动子与GUS基因融合的载体 pCAMBIA1391z-proAaALD化转化青葛后，所获得的转基因青葛中的GUS组织染色图。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人的《分子克隆：实验室手册》(化wYork:ColdSp;ring化;rbo;rLaborato;ryPress，1989年 版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0034] 本实施例设及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3): 38-43》文 献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒PCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道取得，如可 W从澳大利亚GAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
[003引实施例1 AaALD化基因启动子的获得
[0036] 1、培养青葛无菌苗
[0037] 青葛种子用体积分数为75%的乙醇浸泡Imin，再用20%(w/v)的化αο浸泡20min 后，无菌水冲洗3次-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25 °C、1化/她（日光/黑夜)光照培养，14天后即可获得青葛无菌苗。
[003引 2、基因组DNA的提取
[0039] 在1.5血离屯、管中放一片青葛叶片（1cm2左右大小，用冰盒盛取），加入2粒钢珠。加 入300μΙ TPS buffer(通风楓内操作，TPS中含有琉基乙醇），55-60Hz，震荡90s。再加入300μ L TPS buffer(通风楓）d65°C水浴化(每隔20min摇一摇），可适当延长时间，最长1.化。冷却 至室溫，4°C 1000化pm离屯、15min。取30化心40化L上清液。加入30化心40化L异丙醇（异丙醇 在-20°C预冷）。混合后在-20°C冰箱中放置10-15min(可延长至化）。取出4°C离屯、12000rpm， 吸去上清，在通风楓中倒置l〇-15min。加入75%乙醇500-60化L，将沉淀吹打起或用手指弹 起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37°C中烘干，直到沉淀变为透明。加 入50yLdd出0回溶，即获得基因组DNA，4°C保存。
[0040] 3、PCR 扩增
[00川 W上述获得的基因组DM为模板，利用PCR方法扩增AaALDHl基因启动子 proAaALDHl序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据基因组测序得到的 AaALDHl基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，第一轮PCR反应体系如表2所示。 PCR条件为:95°C预变性5min;