黄曲霉毒素b1核酸适配体、dna传感器和试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测领域，更具体地，设及一种黄曲霉毒素 B1核酸适配体，包括该 核酸适配体的DNA传感器，包括该DNA传感器的试剂盒，W及该DNA传感器和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素是主要由黄曲霉、寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和 饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于±壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污 染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为 突出的一类霉菌毒素。在天然食物中W黄曲霉毒素 B1最为多见，危害性也最强。
[0003] 目前已有的黄曲霉毒素检测方法主要有：
[0004] (1)薄层层析法
[0005] 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年它被列为A0AC (Association of Official Agricultural Qiemists)标准方法，该方法同时具有定性和 定量分析黄曲霉毒素的功能。
[0006] (2)液相色谱法
[0007] 液相色谱与薄层层析在许多方面具有相似性，二者互相补充。通常用化C进行前期 的条件设定，选择适宜的分离条件后再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定。
[000引（3)免疫化学分析方法
[0009] 利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析 方法也是常用的黄曲霉毒素检测方法。运类方法通常包括放射免疫分析方法，酶联免疫法 和免疫层析法，它们均可W对黄曲霉毒素进行定量测定。
[0010] 但是运些方法成本高，并且需要使用大型昂贵的仪器，操作繁琐。
[0011] 核酸适配体是一段DNA(脱氧核糖核酸），RNA(核糖核酸)或者是XNA(核酸类似物） 序列。通常是利用体外筛选技术一一指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential en;richment，SE；LEX)，从核酸分子文库中得到的 寡核巧酸片段。核酸适配体能与目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生 物传感器领域。
[0012] DNA传感器WDNA为敏感元件，通过换能器将DNA与其他物质之间作用的生物学信 号转变为可检测的光、电、声波等物理信号。近年来，DNA传感器在基因诊断、环境监控、药物 研究等领域的应用研究受到广泛重视。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种黄曲霉毒素 B1核酸适配体和 DNA传感器W及试剂盒，能够实现操作简单、灵敏度高、成本低的黄曲霉毒素 B1的检测。
[0014] 为了实现上述目的，本发明提供一种黄曲霉毒素 B1核酸适配体，该核酸适配体具 有如下核巧酸序列：
[0015] 5'-GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCTGTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGCCCACA-3'（SEQ ID NO: 1);其中，每个m和n各自独立地为A、T、C或G且m链段和n链段互补配对。
[0016] 本发明还提供一种DM传感器，该DM传感器由W下Ξ部分组成：
[0017] (l)DM(A):通过W下DM序列5'端和3'端连接而成的环状DM模板：5'-XaACCCAACCCGCCCTACCCXb-3'（SEQ ID N0:2);其中，Xa和Xb分别代表a和b个任意碱基，且a+ b = 40-80；
[001引（2)DNA(B):上述的黄曲霉毒素 B1核酸适配体；
[0019] (3)DNA(C):RCA引物，所述DNA(C)的长度为25-50nt且序列具有W下特征：5'端的 15-30个碱基与DNA(A)固定序列的5 '侧翼互补配对，3 '端的10-20个碱基与DNA(B)的5 '端互 补配对。
[0020] 其中，所述DNA(A)固定序列为位于Xa和Xb之间的序列，由于DNA(A)为环状DNA模 板，因此，所述DNA(A)固定序列的5'侧翼不限于Xa中的一部分，也可W包括Xb中的至少一部 分。所述固定序列的互补序列在氯化血红素的存在下，可W催化ABTS的氧化。
[0021 ] 本发明中，所述RCA是指滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)，该术语 的含义和技术步骤为本领域技术人员公知。
[0022] 优选地，所述DNA(A)具有如下核巧酸序列：
[0023] 5 '-ACTGATATTAACCCAACCCGCCCTACCCATTTCTTGTTTCGTATCATTGCGAATACCGTG-3 ' (沈Q ID N0:3)。
[0024] 优选地，所述DNA(C)具有如下核巧酸序列：
[0025] 5'-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCCAGCACGGGAAC-3'（SEQ ID N0:4)。
[0026] 或者优选地，所述DNA(C)具有如下核巧酸序列：
[0027] 5 '-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCACAACAGCACGGGAAC-3 '（SEQ ID NO:5)。
[00%]再或者优选地，所述DNA(C)具有如下核巧酸序列：
[00巧]5，-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCAGAGACAACAGCACGGGAAC-3，（SEQ ID N0:6)。
[0030] 本发明所述DNA传感器通过混合上述Ξ种组分进行自组装即可获得。
[0031] 本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括W下组分：
[0032] (1)黄曲霉毒素 Β1提取液；
[0033] (2)DNA传感器溶液；
[0034] (3)DNA 聚合酶；
[0035] (4)ABTS还原态无色底物；
[0036] (5)氯化血红素溶液化emin溶液）；
[0037] (6)双氧水；
[0038] (7)肥阳S缓冲液；
[0039] 其中，DNA传感器溶液包括W下组分：
[0040] 上述DNA传感器、RCA反应液和dNTP。
[0041 ] 其中，所述DNA传感器溶液中DNA(A)、DNA(B)和DNA(C)的浓度均优选为lO-lOOOnM， 进一步优选为20-100nM。
[0042]其中，所述黄曲霉毒素 B1提取液可W为任何能够溶解黄曲霉毒素 B1的溶液，优选 为甲醇溶液，所述甲醇溶液的浓度可W根据需要确定，例如，可W为70%甲醇溶液。
[0043] 其中，所述双氧水可W为常规的各种浓度，例如为30%的双氧水。
[0044] 本发明中，所述RCA反应液可W为商购DNA聚合酶时所带的反应液，也可W为根据 该反应原理配置而成的反应液(330mM Tris-醋酸(37°C下抑为7.9)，100mM醋酸儀，660mM醋 酸钟，l%(v/v)吐溫20，10mM DTT)。
[0045] 本发明的试剂盒采用一步竞争法，首先组装出含有黄曲霉毒素核酸适配体的DNA 传感器，样品中游离的黄曲霉毒素 B1与黄曲霉毒素核酸适配体DNA(B)特异性结合，使其从 DNA传感器上脱落，从而触发DNA传感器，通过RCA技术得到信号的放大。RCA产物链上有η段 可W催化底物ABTS氧化，从无色变为绿色的DNA序列。从而实现肉眼检巧U。根据竞争性原理， 如果样品中的游离黄曲霉毒素 Β1量多，则脱落下来的黄曲霉毒素核酸适配体多，同时触发 的DNA传感器多，进而有多的信号。反之，则少。设置不同浓度梯度的黄曲霉毒素 Β1标准品， 通过上述方法检测出其信号，将检测不同浓度梯度的黄曲霉毒素 Β1得到的信号画成标准曲 线，此后实际样品中黄曲霉毒素 Β1的浓度通过对比标准曲线得到。
[0046] 本发明的所述黄曲霉毒素 Β1核酸适配体、所述DNA传感器和所述试剂盒可应用于 检测黄曲霉毒素 Β1。
[0047] 具体地，检测黄曲霉毒素 Β1的方法可包括W下步骤：
[0048] (1)将含有黄曲霉毒素 Β1的待测样品与黄曲霉毒素 Β1提取液混合，离屯、并抽提上 清液；
[0049] (2)将所述上清液与DN