重组人肝细胞溶质抗原Ⅰ真核表达载体构建和表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程和生物工程技术领域，特别是设及一种重组人肝细胞溶质抗 原I真核表达载体构建和表达方法。
【背景技术】
[0002] 自身免疫性肝病(ALD)是一类原因不明的、免疫介导的W肝脏为祀器官的自身免 疫性疾病，主要包括W肝细胞胞实质损害为主的自身免疫性肝炎(autoimmune h巧atitis, AH)、和W胆管病变为主的原发性胆汁性肝硬化(prima巧billia巧cirrhosis,PBC)、原发 性硬化性胆管炎(primaiy sclerosing cholangitis,PSC)S组疾病。近年来由于对此类疾 病研究的不断深入W及临床上相关免疫学检测试剂盒不断涌现，发现我国人群中ALD患者 不断增多。
[0003] 抗肝细胞溶质抗原I型抗体(anUbody to liver巧tosol 1 ,LC-1)是Π 型ALD的 一项重要血清学标志，主要存在于儿童和青少年患者中，一般年龄在20岁W下。亚胺甲基转 移酶、环化脱氨酶和精氨基班巧酸裂解酶被确认是LC-1的祀抗原。LC-1抗体对自身免疫性 肝炎的特异性较高，但出现率较低，在大约10%的患者中抗LC-1抗体仅仅是Π 型ALD的血清 学标志。LC-1抗体出现在大约30%的Π 型ALD患者中，而且会和LKM-1(抗肝/肾微粒体抗原1 抗体)一起出现，约50-60%抗LKM-1抗体阳性患者同时抗LC-1抗体阳性。LC-1抗体滴度与疾 病活动程度、血清转氨酶和丙种球蛋白水平明显相关。高效价的抗-1X1只在有着高活动度 的慢性肝炎或肝硬化中检测到。目前，LC-1抗原主要是利用阳性血清通过对流免疫电泳分 离得到的，但由于LKM-1和LC-1抗体往往同时存在，LC-1抗体独特的间接免疫巧光图案有可 能会被掩盖住。
【发明内容】
[0004] 本发明主要解决的技术问题是提供一种重组人肝细胞溶质抗原I真核表达载体构 建和表达方法，得到人肝细胞溶质抗原I融合蛋白及其编码基因，实现利用真核表达系统高 效表达、生产重组人肝细胞溶质抗原I。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种重组人肝细胞溶 质抗原I真核表达载体构建和表达方法，包括步骤为： (1) 合成人肝细胞溶质抗原I基因； (2) 将所述人肝细胞溶质抗原I基因经过限制性内切酶消化后与经过限制性内切酶消 化的真核表达载体在T4连接酶的作用下进行连接，再转化大肠杆菌D册α感受态细胞，经过 鉴定得到带有人肝细胞溶质抗原I基因片段的重组载体； (3) 将鉴定后的所述重组载体转染进入真核细胞中表达得到重组蛋白； (4) 对所述重组蛋白进行亲和纯化，得到目的蛋白。
[0006] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述真核表达载体是具有多克隆位点且 能通过多个调控原件在真核表达系统调控进而表达插入基因的分子生物学载体。
[0007]在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述真核表达载体是能通过信号肤进行 分泌表达或者不带有信号肤进行胞内表达的载体。
[000引在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述真核表达载体为PCDNA3.1(+)载体。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述真核细胞是能表达外源基因的真核 细胞，所述真核细胞不局限于宿主细胞。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述真核细胞为HEK293细胞系。
[0011] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述转染为促进外源基因进入宿主细胞 的方法，所述转染包括化学转染和物理转染。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述转染为脂质体转染方法。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述纯化为利用蛋白的物理性质通过色 谱柱进行亲和纯化，得到目的蛋白。
[0014] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述纯化为采用儀柱对目的蛋白进行纯 化。
[0015] 本发明的有益效果是:本发明的重组人肝细胞溶质抗原I真核表达载体构建和表 达方法，能实现重组的LC-1抗原成功表达，使用重组的LC-1在免疫学检测中能解决间接免 疫巧光图案被遮盖的问题。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获得其它 的附图，其中： 图1是本发明中口。0臟3.1(+)/扣111曰111(：-1重组质粒化6巧邮曰11^1双酶切鉴定图，其中1 为DNAMarker，泳道l为pcDNA3.1(+)AumanLC-l重组质粒Mle巧邮amHI双酶切； 图2是本发明中人LC-1基因融合的阴性血清和阳性血清Western blot分析图，泳道1为 阴性血清，泳道2为阳性血清，Μ为Marker。
【具体实施方式】
[0017] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。
[001引实验材料； 菌株、细胞和载体：大肠杆菌DH5a、HEK293细胞系和PCDM3. 1( + )载体均购自 Invitrogen 公司。
[0019]酶与试剂:限制性内切酶和T4连接酶为Thermo公司产品。
[0020]生化试剂：0PTI-MEMI reduced serum medium，Lipofectamine 2000，TRIzol试剂 购自Invihogen公司；DMEM高糖型培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公 司；His tag抗体购自Cell Si即aling化chnology公司；E化化学发光试剂盒购自化ermo公 司；大肠杆菌培养基为LB，其含有质量体积比(w/v)为1%的蛋白腺、质量体积比(w/v)为ο. 5% 的酵母提取物、质量体积比(w/v)为1%的化C1，抑值为7.0,胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒 和去内毒素质粒提取试剂盒购自Omegabiotek公司。
[0021] 实施例一； 人LC-1基因人工合成 根据GenBank已公开的人Formimidoyltransferase-cyclodeaminase 邑ene的mRNA序列 (GenBank序列登录号:AF289024)，在该基因的5'端添加 Nhel酶切位点，在该基因的3'端的 终止密码子之前添加适用于后续融合蛋白纯化的6X化S标签的基因序列，在3'端的终止密 码子之后添加 BamH I酶切位点，见SEQ ID N0.1，氨基酸序列见SEQ ID N0.2。
[0022] 实施例二 带有人LC-1基因的重组PCDNA3.1(+)的构建 (l)Human LC-1 基因双酶切：LC-1(质粒）2yg、MieI 2yl、BamH I 化l、10XfastDigest buffer 化1，增加 dd出0至50.0μ1，混匀，12000rpm离屯、5秒，37°C酶切30min。
[0023] (2)载体双酶切：PCDNA3.U+)载体化g、NheI 2yl、BamH I 化UlOXfastDigest buffer 化1，增加 dd出0至50.0μ1，混匀，12000rpm离屯、5秒，37°C酶切30min。
[0024] (3)使用试剂盒回收双酶切产物:酶切产物加10μ1 eXLoading buffer、质量体积 tt (w/v)为1.0%的琼脂糖凝胶(含邸）电泳30min，经回收，得到human LC-1基因和PCDNA3.1 (+)载体的酶切产物。
[0025] (4)连接反应（1化1体系）:LC-1基因酶切产物7.扣1、pcDNA3.1 (+)载体的酶切产物 1μ1、10 X T4连接酶buf f