一种龙眼快速转基因方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及龙眼的快速转基因方法，属于转基因植物制备领域，主要应用于龙眼的种质资源创新。
【背景技术】
[0002]龙眼种质创新所应用的转基因方法的研究较少，实验室主要用根癌农杆菌介导的转化法、基因枪转化法，所用的外植体有胚状体、愈伤组织的悬浮细胞系，以根癌农杆菌介导的转化法、基因枪转化法，利用胚状体、愈伤组织的悬浮细胞系为外植体需无菌培养，周期长，成本也高，目前也只得到转化的胚状体，这两种方法并未得到龙眼转基因植株。曾黎辉等采用发根农杆菌介导法，侵染龙眼的胚状体和无菌试管苗，对产生的96条发状根进行培养，只有3条毛状根经体胚发生途径产生胚状体，然后再分化成小植株，得到3个转基因株系，阳性率3.125%，与正常龙眼植株相比，转化植株表现出叶片薄和变小、生长缓慢、卷成茎的形状等异常现象。研究表明发根农杆菌介导法的缺点为转基因植株会表现出顶端优势丧失、叶片皱缩、节间缩短和花形改变等异常现象;此方法还过度依赖植物组织培养，获得胚状体或转化植株的周期长，成本高，转化效率低，后期还需要进行炼苗与移栽等过程，转基因植株容易由此过程造成死亡。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供龙眼快速转基因方法，完全不依赖植物组织培养，以直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料进行侵染，获得转基因植株;不需培育无菌试管苗、胚状体和悬浮细胞，转基因抗性芽不需继代转接，成活率高，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种龙眼快速转基因方法，包括以下步骤:
(1)龙眼直播实生幼苗的准备；
(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备；
(3)实生幼苗去顶芽和去顶(切除带叶的上部)材料的制备、侵染和共培养；
(4)去顶芽和去顶幼苗的抗性芽筛选与培养；
(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定；
(6)转基因植株的移植。
[0005]不依赖植物组织培养，以穴盘直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料快速获得转基因植株的方法。
[0006]具体方法为:
步骤(I)龙眼直播实生幼苗准备方法为:取8成熟以上的龙眼，剥去果皮与果肉，选健康饱满的种子，用清水洗种子后直播于穴盘的营养土中，每穴播I粒种子，25°C温室中暗培养I周，待种子萌发出土后，转移至25°C温室中光照培养2周，至4片真叶期。
[0007]步骤(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备方法为:将携带pCAMBIA1301、pCAMBIA1301-MFT、pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体的根癌农杆菌菌液，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素的25ml YEB液体培养基上，28°C、200 rpm/min暗培养至OD6qq为0.4-
0.8,4000 rpm/min离心10 min收集菌体，并重悬于无抗生素、含有ΙΟΟμΜ的乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl2的25 ml MS液体培养基中，28°C振荡培养2小时后调OD6qq至0.4-1.0，用于侵染。
[0008]步骤(2) pCAMBIA1301-MFT载体制备方法:在MFT基因开放阅读框两端设计特异引物 MFT-F: ATTCTCTAGAATGGCGGCTTCGGTGGATC,下划线为XbaI 酶切位点，MFT-R:GGGGTACCTTAGCGGCGACGGTTGGCC，下划线为KpnI酶切位点，扩增MFT基因并进行TA克隆、测序，XbaI和KpnI双酶切TA克隆质粒与pSPROK载体后将MFT连接到pSPROK载体上，获得pSPROK-MFT，将 pSPROK-MFT 和 pCAMBIA1301 用HindIII 与 EcoRI 双酶切后，将 pSPROK-MFT 双酶切产物 35S-MFT-N0S 连接到 pCAMBIA1301 上，构建 pCAMBIA1301-MFT 表达载体。pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体制备方法:根据MFT基因序列，设计二对方向相反的引物，扩增RNAi正反向插入片段。正向片段引物MFT( + )-F: ATTCTCTAGAAGTGGTGGGTCGGGTTATT，MFT( + )-R:ATTCTCTAGACGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为XbaI酶切位点；反向片段引物MFT(-)-F:TATAGCGGCCGCAGTGGTGGGTCGGGTTATT，下划线为No 11 酶切位点，MFT (-)-R:TATAGCGGCCGCCGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为BamHI酶切位点；正反向片段TA克隆、测序验证后用相应的限制性内切酶切下，连接到PJM007干扰载体上，构建pJM007-MFT-RNAi载体；用卩8丨1酶切？11007-1^1'-1?難丨，回收小片段后，用(:14?进行去磷酸化，用？5^1酶切PCAMBIA1301后，将去磷酸化片段连接到pCAMBIA1301上，构建pCAMBIA1301-MFT- RNAi表达载体。
[0009]步骤(3)实生幼苗去顶芽材料制备、侵染方法为:将4片真叶期幼苗的顶芽去掉保留真叶，用棉花吸取0D_为0.4-1.0的根癌农杆菌菌液后，用摄子将带菌液的棉花紧贴在去顶芽的位置侵染20 min后，用新的带侵染菌液棉花再次侵染20 min，弃带侵染菌液棉花，将吸有无菌水的棉花贴在去顶芽处保湿，在28°C下暗培养4天。
[0010]或步骤(3)实生幼苗去顶材料制备、侵染方法为:将4片真叶期实生幼苗去顶即切除带叶的上部，茎部保留1.5cm-3.5cm，用可拉伸的封口膜或保鲜膜在茎部的切口处缠绕成一小塑料杯形，将OD6qq为0.4-1.0的根癌农杆菌菌液用移液器转移60 ul至小塑料杯形内，在切口处侵染20 min，用棉花吸干后再重复侵染20 min，用棉花吸干，将封口膜或保鲜膜封住切口保湿，在28°C下暗培养4天。
[0011]步骤(4)去顶芽幼苗的抗性芽筛选与培养方法为:暗培养4天后，弃保湿的棉花，用吸有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭去顶芽处2次，然后把带有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花贴在去顶芽处以筛选抗性芽，25°C下暗培养2-3周，当伤口处长出抗性芽时转移到25°C下光照培养。
[0012]或者步骤(4)所述的去顶外植体的抗性芽的筛选与培养方法为:暗培养4天后，将封口膜或保鲜膜打开，用棉签吸60 mg/L的潮霉素溶液后擦拭切口 2次，并在切口处留下I滴潮霉素溶液，再将封口膜或保鲜膜包紧以筛选抗性芽，25°C下暗培养2-3周，当伤口处长出抗性芽时转移到25°C下光照培养。
[0013]步骤(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定方法为:抗性芽长有2片叶以上时，取0.1g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，以pCAMBIA1301载体⑶S标记基因引物⑶S-F: ACG TCCTGT AGA AAC CCC AAC C ；GUS-R: TCC CGG CAA TAA CAT ACG GCG T;扩增片段375 bp，进行PCR检测；再以载体与目的基因的特异扩增片段的引物p-MFT-1-F: GAT GAC GCA CAATCC CAC T；p-MFT-1-R: GGT AGA AGC AGA AAC TTA CGG A;扩增片段678 bp，进行PCR进一步的检测验证，以未转化的再生植株DNA为阴性对照，转化用质粒为阳性对照;抗性芽的扩增产物回收、TA克隆和测序验证。
[0014]步骤(6)转基因植株移植方法:由于实生幼苗是直播于穴盘的营养土中的，可将阳性转基因植株所在的小穴盘沿边缘用剪刀剪下来，在小穴四盘个角落剪一个开口后轻轻撕开，弃小穴盘，将转基因植株连同营养土一起移植到备有营养土的移植袋里，促进龙眼转基因植株根系的生长，提高移植成活率;在转基因植株生长过程中，还可多次进行分子生物学鉴定。
[0015]本发明不需要准备龙眼无菌试管苗，不用诱导胚状体，不用建立愈伤组织的悬浮细胞系，不用继代转接抗性芽，直接在穴盘直播实生幼苗伤口处再生出抗性芽，转基因植株的生长和发育状况正常，每一个阳性的抗性芽即为一个转基因株系，在温室中不受气候与环境影响，可周年进行转化，所以本方法操作步骤简便、成本降低