一种检测adh1b基因*2多态性的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种检测ADH1B基因巧多态性的引物与 方法。
【背景技术】
[0002] 乙醇脱氨酶(ADH1B基因编码)是酒精代谢的关键酶之一，其突变可影响酒精代谢 进而引起乙醒等有害物质的堆积，影响身体健康。研究表明，ADH1B基因位点存在3个等位基 因，分别编码3个亚基，即01(4畑1帖1)，的(4面1帖2)和盼(4〇化8*3)。4畑1帖2等位基因编码 的的多肤组成的乙醇脱氨酶具有高活性。ADH1B基因*2多态性(NM_000668.5 : C . 143A〉G， p.His48Arg)可导致乙醇脱氨酶活性极大增强，乙醇代谢至乙醒的速度较快，促进了体内乙 醒的堆积。因此，ADH1B基因巧基因多态性可导致饮酒后体内乙醒堆积，当血液中乙醒达到 一定浓度时，会出现面红、头痛、屯、动过速、呼吸苦难等不适，表现为对酒精的不耐受性，称 为面红反应。带有ADH1B*2等位基因的个体饮酒后比带有ADH1B*1等位基因的个体有更不愉 快的反应，因此，他们具有更低的饮酒频率。同时，有研究表明ADH1B巧等位基因是A畑1B和 A畑1C基因多态性中负责酒精中毒易感性的位点。
[0003] 检测A畑1B基因巧多态性对指导人们健康饮酒和降低酒精中毒的发生具有重要的 意义。中国专利申请201510085568.2公开了一种检测ADH1B基因的单一核巧多型性R49H的 基因型和ALD肥基因的单一核巧多型性E487K的基因型的引物组和定序引物，但其用于检测 ALDH2基因*2和ADH1B基因巧多态性准确度不足。现有技术缺少一种检测特异性和灵敏度 高、准确性和精密性好的A畑1B基因巧多态性检测引物及其方法。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测ADH1B基因巧多态性的引物 与方法，具有检测特异性和灵敏度高，准确性和精密性好等优点，实现了ADH1B基因巧多态 性的检 ii。本发明检测的位点为 ADH1B 基因 *2(NM_000668.5:c. 143A〉G，p.His48Arg， rsl229984)。
[000引本发明提供一种检测ADHIB基因*2多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物;所述PCR扩增引物为上游引物5'- CAACACTCTCCACGATGC-3'（SEQ ID N0.1)和下游 引物5'-TGAACAGCTTCTCTTTATTCT-3'（SEQIDN0.2);所述SNaPshotPCR引物为5'-TTTTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC-3 '（沈Q ID NO.3)。
[0006] 采用上述技术方案，本发明提供的检测ADH1B基因*2多态性的引物，可W实现 A畑1B基因巧多态性的特异性检测，准确性好。
[0007] 相应地，本发明还提供一种检测A畑1B基因巧多态性的方法，包括如下步骤： 51、 提取DNA样品； 52、 W步骤S1所述的DNA样本为模板，利用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重 PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，； 53、 W步骤S2所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1中所述的挪aPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； 54、 采用毛细管电泳技术对步骤S3所述的纯化后的挪aPshot PCR扩增产物进行检测， 并对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[000引优选地，所述步骤S1中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[0009] 优选地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:98°C预变性3min，98°C变性 10s，58°C退火30s，72°C延伸Imin，进行29个循环，最后72°C延伸5min，结束后25°C保溫。
[0010] 优选地，所述步骤S3中的挪aPshot PCR扩增反应条件包括:96°C变性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，进行25个循环，结束后4°C保溫。
[0011] 优选地，所述步骤S4中，采用GE肥MAP阳RID V4.1软件对检测结果进行分析。
[001引此外，本发明还提供检测A畑1B基因巧多态性的引物在制备检测A畑1B基因巧多态 性试剂中的用途。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供了一种检测A的ΠΒ基因巧多态 性的引物，该引物的特异性和准确性好，可用于实现ADH1B基因巧多态性的检测，检测效率 高。此外，本发明还提供了一种检测ADH1B基因巧多态性的測aPshot法，通过使用特异性的 PCR扩增引物和S化Pshot PCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性和精密性好等优点，检 测结果可用于指导人们健康饮酒和降低酒精中毒的发生。
【附图说明】
[0014]图1本发明提供的A畑1B基因*巧I物的部分扩增片段。
[001引图2本发明提供的A畑1B基因*巧I物扩增产物的部分测序图。
[0016]图3样品的A畑1B基因巧多态性检测结果图。
【具体实施方式】
[0017] W下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护化围。
[0018] 实施例一引物 发明人针对ADH1B基因巧的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优 化和比较，筛选出了特异性好的引物。本发明提供的引物如表1所示。本发明提供的所有引 物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
[0019] 实施例二引物的特异性 将本发明提供的A畑1B基因巧引物于UCSC中进行Blasting,结果如下：ΑΜΠΒ基因巧扩 增片段位于C虹4:100239170+100239459,长度为290bpDADHlB基因巧特异引物的扩增片段 及基因组位置如图1所示，引物的扩增片段覆盖了相应的检测位点ADH1B基因*2,无其它同 源基因。
[0020] 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品DNA进行扩增及Sanger测序，部分测序结 果如图2所示。测序结果显示，引物扩增片段与A畑1B基因巧基因参考序列吻合。A畑1B基因* 2基因参考序列号为ADH1B NC_000004.12，NM_000668.5。
[0021 ] 使用表1中測aPshot PCR引物，S化Pshot法进行检测，部分结果如图3所示。从图3 可知，产物峰的相对位置及测序反应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。
[0022] 实施例Ξ A畑1B基因巧多态性的检测 1、提取抓TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自 Τ iagen，货号DP318 )的说明书，将DNA样品稀释至1 OOngAiL，备用。
[0023] 2、多重PCR扩增 (l)PCR扩