一种检测黄牛Leptin基因单核苷酸多态性的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子遗传学领域，设及基因单核巧酸多态性（Single Nucleotide Polymor地ism, SNP)的检测，特别设及一种检测黄牛L邱tin基因第12265位单核巧酸多态性 的方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性(SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核巧酸(A/T/C/G)的替换而 引起的多态性，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失W及重复序列拷贝数的变化。 在二倍体生物群体中，SNPs理论上可由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等 位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被称为二等位基因分子标记。根据SNPs在基因组中分布 的位置，又可划分为基因编码区SNPs (cSNPs)、基因周边SNPs (pSNPs)和基因间SNPs (iSNPs) 等类型。其中，cSNP造成的影响较大，又可分为两种类型：同义cSNPs和反义cSNPs。同义 cSNPs不改变氨基酸的序列，通常通过影响mRNA的稳定性或密码子的偏好性改变基因的转 录效率;反义cSNPs则可导致氨基酸序列发生改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因而，反 义cSNPs在动物遗传育种中具有非常重要的研究价值和意义。
[0003] 分子育种，即分子标记辅助选择育种(Mole州lar Mark-Assist Selection,MAS)， 是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，借助DNA分子标记对遗传资源或育 种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，实现新品种的选育。标记辅助选择主要 经历了 Ξ个阶段:第一阶段是家畜各性状间的遗传分析;第二阶段是蛋白质（酶)标记对数 量性状的标记阶段;第Ξ个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术的日渐成熟与丰 富，覆盖整个基因组的标记越来越多，通过与QTL间的连锁分析，可间接实现辅助选择性状 的目的。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。在 肉牛育种中，人们期望通过对与生长性状有密切相关、并且与数量性状紧密连锁的DNA标记 进行选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得较大的研究 进展。
[0004] 目前，主要采用几种不同的路线来筛别SNPs:即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA 测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核巧酸连接反应、PCR-RFLP或f orced-PCR-RFLP方 法等。在运些SNP检测技术中，DM序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是其检测费用 昂贵，需要有DNA测序仪等大型仪器，同时需要非常熟练的技术人员和丰富的经验，因此该 方法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法 检测SNP可W适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验 过程中存在假阳性问题，所W，也并非理想的SNP检测手段;AS-PCR方法作为一种新型的SNP 检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物， 且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍 应用的特点；而引物延伸法和寡核巧酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因 忍片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上 所述，利用PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP技术进行SNP检测可能是当前检测SNP最理想的遗 传标记方法。本试验中的f or ced-PCR-R化P是在发现SNP位点后通过对引物中引入错配碱 基，使之与SNP位点共同构成酶切位点实现基因分型的一种方法。通过PCR扩增，使用限制性 内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙締凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。该方法 既具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，是目前可实际应 用于生产实践的方法。
[000引瘦素（leptin)是1994年在遗传性肥胖小鼠的脂肪组织中克隆得到的一个脂肪细 胞分泌因子基因。小鼠的leptin基因由166或167个氨基酸组成，前端是21个氨基酸的信号 肤。该蛋白结构高度保守，可形成分子内具有二硫键的球蛋白。瘦素可通过结合位于下丘脑 内特定神经元上的瘦素受体，激活JAK2-STAT3、PI：3K和E服等信号转导通路，发挥抑制食欲、 促进能量消耗，减少脂肪含量的功能。在牛、猪、羊等家畜上的报道显示，leptin基因多态性 与肉质性状、生长性状等部分指标存在显著相关。目前，大量的研究证明leptin是能量代谢 和肥胖症强有力的调制器，在调节体重和脂肪沉积方面发挥着非常重要的作用。
[0006] 然而，leptin基因的研究绝大多数是在人和小鼠等模型动物上进行。在中国地方 黄牛群体中，该基因编码区还缺乏比较系统的研究，国内外关于牛leptin基因错义突变的 报道也较少。因此，该基因的功能研究及其错义突变位点与生长性状指标（如:体重、日增 重、体高、体长、胸围指数等）关联的分析，可为进一步改良我国地方黄牛品种提供理论基 础。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的问题在于提供一种检测的黄牛Leptin基因单核巧酸多态性的方法， 寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。
[0008] 本发明是通过W下技术方案来实现：
[0009] -种检测黄牛Leptin基因单核巧酸多态性的方法，W包含Leptin基因的待测黄牛 全基因组DNA为模板，W引物对P为引物，PCR扩增黄牛L邱tin基因的第二外显子区；用限制 性内切酶Pst I消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙締酷胺凝胶电泳； 根据聚丙締酷胺凝胶电泳的结果鉴定黄牛Leptin基因第12265位的单核巧酸多态性；
[0010] 所述的引物对P为：
[0011] ?1(上游引物）：5'-6了60：1'1'1^47^(：了61^41'1'1'(：-3'236口
[0012] P2(下游引物）：5'-TGTCATCCTGGAC^TGC-3' 18bp [001引注：引物中的表示为了形成酶切?立点引入的错配碱基 [0014]所述的PCR扩增反应程序为：
[001 引 95°C 预变性 5min; 94°C 变性 30s，59°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，30 ~35 个循环;72°C 延伸10min;4°C保存
[0016] 所述的聚丙締酷胺凝胶电泳为质量浓度为12%的聚丙締酷胺凝胶。
[0017] 所述根据聚丙締酷胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Leptin基因第12265位的单核巧酸多 态性为:TT基因型表现为28化P和15bp两条带;CT基因型表现为296bp，28化P，15bpS条带； CC基因型表现为29化P-条带。（其中15bp的片段因条带过小不能在聚丙締酷胺凝胶电泳上 显示，但不影响带型的判定）。
[0018]与现有技术相比，本发明具有W下独特的技术效果：
[0019] 本发明根据已公布牛Leptin基因（NCBI:AC_000161.1)的序列设计引物，分别W5 种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄 牛Leptin基因的部分序列与NCBI公布的序列(NCBI:AC_000161.1)进行比较，发现在Leptin 基因的第12265位存在SNP多态性。
[0020] 针对上述第12265位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩 增后，用特定的限制性内切酶进行酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核巧 酸的多态性：
[0021 ] PCR扩增L邱tin基因的第12264bp~12269bp序列为C]；GCA:G时，其能被限制性内切 酶Pst I识别；当上述该位点发生TX：突变时，PCR扩增L邱tin基因的第12264bp~12269bp序 列为CgiCAG，此时不能被限制性内切酶Pst I所识别，运样就可W对该位点SNP多态性进行 检测。序列中最后一位加粗的G为下游引物中引入的错配碱基(表现在反向引物上为其互补 序列C)，它可与12265位的SNP共同构成Pst I的识别位点。
[0022] 由于Leptin基因功能设及初生重、体重、日增重、体高、胸围、体斜长、坐骨端宽等 生长性状。本发明提供的检测方法为Leptin基因的SNP与黄牛部分生长性状(体高、体重和 体长等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高南阳牛早期生长性状初生重、体重、 胸围指数的分子标记，W便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS),快速建立遗 传资源优良的黄牛种群。
【附图说明】
[0023] 图1为黄牛L邱tin基因包含第12265位的多态位点的29化P PCR产物电泳检测图； 其中，泳道1-6为Leptin基因包含第12265位的多态位点的296bp片段的琼脂糖电泳检测图； 泳道Μ为Marker DL500 (500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，1 OObp，50bp);
[0024] 图2为Pst I化FP-PCR方法检测黄牛Leptin基因第二外显子SNP(AC_000161.1: g.l2265T〉C)序列分析图，其中带框部位分别表示上下游引物序列，红色背景的碱基表示 SNP位点，黄色背景的碱基表示下游引物中引入的错配，目的是与SNPs共同构成Pst I的酶 切位点。黑色下划线为Pst I的识别位点。
[0025] 图3为黄牛Leptin基因第12265位不同基因型聚丙締酷胺凝胶电泳检测图(a)和测 序图（b);其中，图（a) :ΤΤ基因型个体(28化P和15bp) ;CT基因型个体(296bp，28化P和15bp); CC基因型个体（296bp) ;M:DL500(500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，lOObp，50bp)。注：巧bp 条带太短不能在聚丙締酷胺凝胶电泳上显示，但不影响带型的判定；图（b):纯合型个体TT 和CC在该位点呈现单一峰，杂合型个体CT在该位点呈现双峰。注："▼"为突变位点/'方框" 为该位点引物中引入的错配碱基