用于检测il28b基因多态性的探针、基因芯片和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体的设及用于IL28B基因多态性检测的探针、基因忍 片和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒化epatitis C virusJCV)引起的一种传染 病。HCV感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一，我国HCV感染率约为3.2%，每年新发丙 肝病例约3.5万例。目前，丙型肝炎尚无有效疫苗预防感染。
[0003] 人IL28B基因位于染色体19ql3.13的AC011445.6基因群上，属于ΙΠ 型干扰素家 族，编码ΙΡΝ-λ3。IL28B基因由6个外显子和5个内显子组成，含有由
[0004] 22个氨基酸组成的信号肤。研究发现丙型肝炎的治疗与宿主的IL28B基因多态性 高度相关。IL28B基因的两个多态性位点rsl2979860和rs8099917与丙型肝炎病毒患者的病 毒清除有显著的相关性，即与丙肝患者标准化治疗方案(聚乙二醇干扰素联合利己韦林)的 抗病毒治疗效果密切相关。
[0005] 随着IL28B基因多态性临床诊断价值的出现，市场上有各种检测试剂盒诞生。如基 因测序、高分辨率溶解曲线法化igh-resolution melting analysis，HRM)、杂交探针法 化ybridization p;robe，HP)、TaqMan探针法、PCR等。其中，基因测序法操作繁琐，工作量大 成本高;HRM法操作繁琐，需用测序法对所得结果进一步确认且必须用特殊的仪器设备;HP 法成本较高；TaqMan探针法成本高，结果受化q酶活性影响较大，只能用于少量SNP位点分 析，需要特殊的仪器设备，不能发现未知SNP位点;PCR每次只能检测一种突变要多管体系相 对应，存在操作不便的缺点。
[0006] 本发明采用的基因忍片进行检测，其检测通量大，在一张忍片上一次性完成两个 位点多态性的检测，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。传统 的基因忍片技术的检测，是基于巧光标记探针的巧光发光来进行检测的。其信号弱，必须经 过激发，才能发光，需要昂贵的激光扫描设备。在临床检测应用过程中，由于检测单位需要 投资购置激光扫描设备，一方面，显著增加了进行相关检测的投资成本，另一方面，也直接 增加了应用成本，限制了该技术的市场应用与推广。本发明可通过生物忍片的可见光光学 放大，做到了信号分辨率高，信号可W用普通数码相机拍照或肉眼直接判读。相对传统巧光 标记具有良好的效果。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术不足，提供一种快速准确、结果直观的IL28B基 因多态性检测的基因忍片和试剂盒。
[000引为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
[0009] -组用于IL28B基因多态性检测的探针，包括rsl2979860和rs8099917位点的探 针;所述探针序列为：
[0010] rsl2979860-C 探针：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT;
[0011] rsl2979860-T 探针：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT;
[0012] rs8099917-T探针：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT;
[0013] rs8099917-G 探针：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT。
[0014] 进一步地，本发明的内容还包括用于IL28B基因多态性检测的基因忍片，其特征在 于，所述基因忍片包括固体相和权利要求1所述探针。
[0015] 进一步地，本发明的内容还包括用于IL28B基因多态性检测的基因忍片试剂盒，其 特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述探针或权利要求2所述基因忍片。
[0016] 进一步地，所述基因忍片试剂盒还包括W下引物对：
[0017] rsl2979860 引物对：
[001 引上游通用引物FP1:5 ' -CGCGATGCCCCGGGCCACG-3 ' ；
[0019]下游通用引物RPl:5'-Bio GGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3'；
[0020] rs8099917 引物对：
[0021] 上游通用引物FP2:5 ' -CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3 ' ；
[0022] 下游通用引物RP2:5'-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3'。
[0023] 进一步地，所述引物上含有有生物素标记。
[0024] 进一步地，所述基因忍片试剂盒还包括PCR反应体系、阴性对照品、阳性对照品、杂 交缓冲液、洗涂液、BW反应液和TMB显色液。
[0025] 进一步地，所述阳性对照品为9860-Τ，9917-Τ型样本浓度106-10 9copies/ml，所述 阴性对照品为生理盐水。
[00%]进一步地，所述杂交缓冲液为巧樣酸Ξ钢0.3M、氯化钢3M、十二烷基硫酸钢0.3M、 Triton X-1000.1 %水溶液。
[0027]进一步地，所述洗涂液分为洗涂液A和洗涂液B，所述洗涂液A为0.01-0.1N化0H溶 液，所述洗涂液B为0.1 X SSC溶液。
[002引进一步地，所述BW反应液为用20 X SSC缓冲液将HRP标记的亲合素稀释到1:5000~ 1:10000。
[0029] 为了更好地理解和实施，下面详细说明本发明。
[0030] 本发明通过特异性的引物和探针的选择，结合基因忍片技术，不仅提高了检测效 率和准确度。
[0031] 本发明通过PCR技术对病原体DNA进行扩增，扩增产物与生物忍片上的寡核巧酸探 针进行杂交，通过通过生物素标记，显色液进行显色后，直观的表现检测结果。
[0032] 本发明的基因忍片试剂盒，通过生物忍片的可见光光学放大，做到了信号分辨率 高，信号可W用普通数码相机拍照或肉眼直接判读。相对传统巧光标记具有良好的效果。为 了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【附图说明】
[0033] 图1是本发明采用基因忍片对人工合成的核酸链对应包含有待检测的特异性基因 序列的9860CC质粒，9860TT质粒，9917TT质粒，9917GG质粒进行扩增和检测结果。
[0034] 图2A、B、C、D、E分别对不同浓度9860CC质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
[00巧]图3A、B、C、D、E分别对不同浓度9860TT质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
[0036] 图4A、B、C、D、E分别对不同浓度9917TT质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
[0037] 图5A、B、C、D、E分别对不同浓度9917GG质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
[003引图6为9860CC、9860TT、9917TT和9917GG四种样本提取DNA后杂交检测结果。
[0039] 图7A、B、C、D、E、F为6组基因型为9860CC的标本提取DNA后杂交检测结果。
[0040] 图8A、B、C、D、E、F为6组基因型为9860TT的标本提取DNA后杂交检测结果。
[0041 ] 图9A、B、C、D、E、F为6组基因型为9917TT的标本提取DNA后杂交检测结果。
[0042] 图10A、B、C、D、E、F为6组基因型为9917GG的标本提取DNA后杂交检测结果。
【具体实施方式】
[0043] 【实施例1】忍片和检测试剂盒的制备
[0044] 基因忍片：按真空气相沉淀法锻膜，使用旋转真空锻膜机在厚度约为2.5mm，直径 20cm娃片（Si〇2)上锻上475埃的氮化娃及135埃的TSPS的薄膜，制备出相应的生物传感器， 并覆盖150埃的多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，最后经过1-lOuM盐酸班巧酸酷亚胺基烟酸盐处 理20分钟，清水洗净供忍片制作。将氨基修饰的探针，按照表1排列分别将探针点样到处理 好的忍片上，探针序列如表2所示;每组设两个平行点样点：室溫下反应，制备出包含探针的 基因忍片。
[0045] 表1基因忍片探针点样排列
[0048] 表2点样的探针序列[0049]
[0046]
[0047]
[0050] 试剂盒:本实施例中试剂盒的组成如表3:
[0化1 ] 表3试剂盒组成
[0化2]
[0053]【实施例2】杂交反应过程
[0化4] 本实施例中基目标因片段rsl2979860(C/T)和rs8099917(T/G)如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID ^.2所示。含有目标片段的质粒9860(：(：质粒，98601'1'质粒，99171'1'质粒， 99