用于检测sept9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因甲基化快速分子诊断领域，具体设及用于检测SEPT9基因甲基化 的组合物与试剂盒W及方法。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌(CRC)是世界第Ξ常见恶性肿瘤，每年新发病例数约120万，约死亡病例 数约61万人(2008年）。近20多年来，世界上多数国家结直肠癌（主要是结肠癌）发病率呈上 升趋势。在美国每年约有15.4万新发直结肠癌患者，其中每年死亡人数超过5.2万。中国结 直肠癌发病率上升趋势也十分明显。中国每年有超过40万新发直结肠癌患者，直结肠癌死 亡19.5万，平均增速为4.2 %远超过国际平均水平的2 %。
[0003] 根据世界卫生组织统计表明，北美国家直结肠癌患者5年生存率约为60%，而中国 对应仅有32%。直结肠癌生存期与疾病的严重程度、分期相关，由于我国在直结肠癌的诊断 水平，民众早诊意识等方面薄弱，80% W上为中晚期患者，早期诊断比例仅为11.8%。而有 效的早期直结肠癌患者可使直结肠癌发病率降低60%，病死率降低80%。
[0004] 目前，直结肠癌非侵入式检测方法用于疾病的筛查有效力非常低下，因为需要患 者每年收集粪便样本便潜血试验或粪便免疫化学巧光检测，假阳性比率高，结果稳定性差， 总体受检率小于3%。尽管乙状结肠镜检查或结肠镜检查检出率较高，是直结肠癌检查的金 标准，但是需要患者做清理肠道准备、依靠麻醉并且侵犯隐私，患者会产生恐惧屯、理，检查 出血或者感染等情况，总体依从性较差，受检率小于5%。因此，高特异性、高灵敏度、依从性 好、非侵入式的直结肠癌早期诊断技术亟待解决。
[000引DNA甲基化是调苄基因表达转录的表观遗传方式之一，普遍存在与哺乳动物中。 DNA甲基化主要发生在基因上游启动子CpG到的胞喀晚上，形成CpG基因岛，关闭下游基因的 表达。异常的DNA甲基化对基因表达的调控是肿瘤发生发展中的重要特点之一，并且在直结 肠癌中被广泛验证。近年来，研究者发现患者血浆中大量基因甲基化包括P16、BMP3、NDRG4、 SEPT9等与直结肠癌的发生、发展相关。其中，SEPT9(或成为S邱tin9)是广泛存在于真核生 物中的进化上保守的细胞骨架GWase蛋白，参与多项细胞生命活动包括细胞分裂、极化、细 胞调亡等。血浆中SEPT9基因 V2拼接体启动子甲基化与直结肠癌的发生和发展密切相关，基 因甲基化情况能有效区分直结肠癌患者与健康人群，可单独作为直结肠癌诊断、预后的指 标。
[0006] 针对SEPT9基因 V2拼接体启动子甲基化水平有CN201410452285.2、 CN201410030771.5 和 CN201510264501.5dCN201410452285.2根据甲基化与非甲基化亚硫酸 氨盐处理后序列不同，PCR扩增的溫度溶解曲线不同而产生不同的巧光峰值，来对SEPT9基 因甲基化进行检测与定量。然而高分辨溶解曲线仅能在如LightCycleWM 480PCR或 Li曲tScanner等少量仪器可W使用，并且技术要求高，不利于广泛推广。CN201410030771.5 采用五对引物、五条Blocker和五条探针对SEPT9基因甲基化，检测成本较高，扩增反应复 杂，易出现引物、探针干扰导致检测结果不稳定。CN201510264501.5通过引入脱氧次黄嚷岭 核巧酸碱基（I)，检测时需同步进行两个反应体系，检测结果由两个反应体系进行比较获 得，检测成本较高且结果判读复杂。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有的不足，提供了一种利用一对引物、一条阻拦序列（即Blocker)和 一条探针检测患者血液中SEPT9基因 V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有成本低 廉、检测方便、灵敏性高的特点。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0009] 86?了9基因￥2拼接体启动子甲基化的核巧酸序列如56〇10^.8所示，为 GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTAT TAT：CG GATTT CGCG GTTAACGGG TAGTTGGAT GGGATTATTTCGG，其中，加粗部分核巧酸为SEPT9基因 V2拼接体启动子甲基化位点。
[0010] 本发明提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，包括上游检测引物和下游 检测引物构成的引物对；
[0011] 所述上游检测引物包括SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，所述SEQ ID NO. 1所示的 核巧酸序列为5 ' -AAATAATCCCATCCAACTA-3 ' ；
[0012] 所述下游检测引物包括SEQ ID NO.2所示的核巧酸序列，所述SEQ ID NO.2所示的 核巧酸序列为5 ' -TTAACCGCGAAATCCGAC-3 '。
[0013] 用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至2(K)bp的范围中，运可W使得能够 在短时间内特异性基因。
[0014] 利用本发明提供的上述引物检测人直结肠癌基因基因甲基化时，与传统检测方法 相比，本发明具有检测方便、灵敏度高和特异性好等优点。
[0015] 进一步，还包括具有阻拦序列的DNA片段，所述阻拦序列的DNA片段用于结合非甲 基化SEPT9基因，在甲基化SEPT9基因经过亚硫酸氨盐转化后的产物中，该阻拦序列的DNA片 段在PCR反应退火过程中优先于上述的引物对结合非甲基化SEPT9基因。
[0016] 进一步，所述阻拦序列包括SEQ ID NO.3所示的核巧酸序列，优选地，所述阻拦序 列为SEQIDN0.3所示的核巧酸序列，并在3'端具有3'-SpacerC3，为5'-GTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTMTGTGTAG-C3-3 \
[00Π ] C3(即3'-Spacer C3，dSpC3)主要用于模仿核糖的3'和5'径基间的；碳间隔，或 "替代"一个序列中未知的碱基。C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶 发挥作用。
[0018] 上述序列可W阻拦上游检测引物与非甲基化SEPT9基因结合。
[0019] 进一步，还包括检测探针，所述检测探针与引物对中的上游检测引物或下游检测 引物匹配。
[0020] 进一步，所述检测探针包括SEQ ID NO.4所示的核巧酸序列；优选地，所述检测探 针为SEQ ID NO.4所示的核巧酸序列。
[0021] 进一步，所述检测探针的5'端标记有巧光基团，所述检测探针的3'端标记有泽灭 基团。
[0022] 上述探针可选用下述任一巧光基团在其5'端标记^41、￥1(：、了61'、1(^、皿乂、〔￥3、 CY5、R0X、RED610、TEXAS RED、RED670、肥D，选用下述任一泽灭基团在其3'端标记：6-TAMRA、 BHQ-1~3、和结合分子沟的非巧光泽灭剂（Minor Groove Binder nonf luorescent quencher，MGBNFQ)。优选地，巧光标记物选择FAM，泽灭剂选择肌Q-1。
[002引进一步，还包括内标引物对和内标探针；
[0024] 所述内标引物对包括上游内标引物和下游内标引物，为用于扩增β-actin基因；
[0025] 上游内标引物包括SEQ ID NO.5所示的核巧酸序列，所述SEQ ID NO.5所示的核巧 酸序列为5 ' -TTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3 '，
[0026] 下游内标引物包括SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，所述SEQ ID NO.6所示的核巧 酸序列为5 ' -CACCAACCTCATAACCTTATC-3 ' ；
[0027] 内标探针，即β-actin探针，该探针包括SEQ ID ^.7所示的核巧酸序列，所述56〇 IDN0.7所示的核巧酸序列为5'-CCACGGACGATAGTGTTGTGG-3'，内标探针的5'端标记 有巧光基团，所述内标探针的3'端标记有泽灭基团。
[0028] 优选地，上游内标引物为SEQ ID NO.5所示的核巧酸序列，下游内标引物为SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，内标探针为SEQ ID NO.7所示的核巧酸序列。
[0029] 用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至2(K)bp的范围中，运可W使得能够 在短时间内扩增特异性基因。上述内标换针可选用下述任一巧光基团在其5'端标记:FAM、 VIC、TET、JOE、肥X、CY3、CY5、R0X、RED610、TEXAS RED、RED670、肥D，选用下述任一泽灭基团 在其3'端标记:6-TAMRA、BHQ-l~3、和结合分子沟的非巧光泽灭剂(Minor Groove Binder nonf luorescent quencher ,MGBNFQ)。优选地，巧光标记物选择肥X，泽灭剂选择B册-1。
[0030] 本发明还提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒，包括上述的用于检测 SEPT9基因甲基化的组合物，W及PCR反应试剂、基因组提取液、基因组甲基化处理液、阳性 对照品、阴性对照品中的一种或者多种。
[0031] 可W将用于检测SEPT9基因甲基化的组合物W及PCR反应试剂预先配制成PCR反应 液，具体可W按照下列反应体系配制：
[0032]
[0033] ~所述基因组提取液至少包含细胞裂解液体、磁珠溶液、磁珠清洗液、基因组洗脱液胃 的一种或者多种；
[0034] 细胞裂解液体：3.6mol/L 加 HCl，10mmol/L Tris-肥l，lmmol/L 抓TA，l/4体积异 丙醇，0.1 %SDS，2%TritonX-100，1 % 的β-琉基乙醇，800mmol//L 化Cl，200mmol/L巧樣酸 纳，抑=6.8;
[0035] 磁珠溶液:氧化娃磁珠悬浮液
[0036] 磁珠清洗液：800mmol/L LiCl，100mmol/L 化Cl，50mmol/L ]\?^5,60%乙醇，抑= 7.0;
[0037] 洗脱缓冲液：10mm〇l Tis-HCl，lmmo化DTA,抑=8.0;
[0038] 所述基因组甲基化处理液包括亚硫酸氨盐溶液、DME自由基清除液、poly(A)溶液、 结合缓冲液的一种或者多种。
[0039] 实施例中的亚硫酸氨盐溶液采用的是亚硫酸钢和亚硫酸氨钢的混合溶液，具体配 制方法如下：分别称取4.71mg亚硫酸氨钢和1.13mg亚硫酸钢溶解在10毫升去离子水中，通 过剧烈振动与加热(50°C)，抑调整为5.4-5.5。