一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 凝胶迁移或电泳迁移率检测巧lectro曲oretic mobility shift assay,EMSA)是 研究启动子结合蛋白的经典方法，是一种用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技术。 EMSA基本过程是将畔或33P标记或非放射性标记的包含特异的DNA位点的DNA片段与DNA结 合蛋白共同解育后进行电泳分析，蛋白-DNA复合物通过EMSA与游离DNA分离开来，蛋白质阻 碍与其所结合的DNA片段的移动性。因此，游离DNA比DNA-蛋白质复合物移动的更快，凝胶的 图像可W掲示游离和结合的标记的DNA的位置。EMSA不仅简单、迅速、灵敏度高;且可W用竞 争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。目前，EMSA可W用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋 白，并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质，EMSA还可W结合蛋白双向电泳及质谱 技术进行未知蛋白的鉴定分析。
[0003] 随着EMSA技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重 要。Jiang X等用EMSA方法证明了API能够结合在启动子的功能区域，并且调控LoVo细胞的 PPARdelta的表达（Jiang,X. ,et al. .Transcription factor API binds the functional region of the promoter and regulates gene expression of human PPARdelta in Lo Vo cell. Tumour Biol ,2013.6(:34) :p. 3619-3625) Jatanin 是参与微管切断 ATP 酶家族 成员的蛋白质，它的两种异源二聚体结构由KATNAl和KATBl编码，而Elkl能够与微管相互作 用，Selcuk E等用EMSA方法证明Elkl能够结合KATB1启动子，调控其表达（Selcuk，E.， D.Canbaz and A.Et,Katanin-p80gene promoter characterization and regulation via Elkl. PLoS One ,2013.7(8):p. e69423)。凝胶阻滞电泳分析显示青葛素激活PXR与 CYP3A4 DNA结合的能力，表明CYP3A4的诱导是由青葛素通过PXR的活化所介导化u，D.，et al..Artemisinin protects against dextran sulfate-sodium-induced inflammatory bowel disease,which is associated with activation of the pregnane X receptor.E；ur J Pharmacol,2014(738C):p.273-284)。
[0004] 现如今的研究中，EMSA探针主要是合成生物素标记的单链探针，再通过变性、复性 实验得到的双链探针。如Kim JR等运用生物公司合成的3'末端被生物素标记的正、反单链 EMSA探针，并在室溫下复性得到双链探针化im,J. ,S.Mathew and P.Mathew,Blimp-1/ PRDMlregulates the transcription of human CSl(SLAMF7)gene in NK and B cells. Immunobiology,2015.221(1) :p.31-39)。又如Grycov自A等、Hsu FT等亦分别通过设 计合成包含转录因子结合位点的单链EMSA探针，之后通过低溫复性得到双链探针，进而开 展填！胶迁移率实验（Aneta,G. ,D.Aneta and D . Zdenek , Impurities contained in 曰ntifung曰1 drug ketocon曰zole 曰re potent 曰ctiv曰tors of hum曰n 曰ryl hydroc曰rbon receptor.TOXICOLOGY LETTERS,2015.239(2):p.67-72;Hsu,F.,B.Qiang and C.John, Synergistic Effect of Sorafenib and Radiation on Human Oral Carcinoma in vivo.SCIENTIFIC 赃PORTS,2015.5)。
[000引上述EMSA探针的合成方法具有3点较明显的缺点：（1)通过复性得到的双链探针的 比例难W保证，容易造成实验结果的假阴性；（2)复性不彻底的单链探针的显影亮度远高于 蛋白-DNA复合物结合条带的显影亮度，造成假阴性，且双链探针比例较低影响阳性结果的 显影;（3)需要合成大量的单链探针，成本较高。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的第一个目的是提供一种EMSA探针，本发明的第二个目的是提 供该探针的制备方法，本发明的第Ξ个目的是提供使用该探针的EMSA方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种EMSA探针，包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5' 及3'端的接头序列。
[0009] 优选地，所述接头序列为回文序列。
[0010] 优选地，所述接头序列的长度为8-15nt。
[0011] 优选地，所述接头序列的长度为12nt。
[0012] 优选地，所述接头序列经生物素标记和LNA修饰。
[0013] 优选地，所述转录因子结合序列含有简并序列。
[0014] 更优选地，所述接头序列为GGGTCTAGACCC。
[0015] 更优选地，所述接头序列为GCATCATGATGC。
[0016] 更优选地，所述接头序列为GGGCTAGCCC。
[0017] 更优选地，所述第一条链的序列为GGGTCTAGACCCGTGTC服KCTRGGGTCTAGACCC，其中 H=A/C/T，K=G/T，R=A/G。
[0018]更优选地，所述第一条链的序列为 GCATCATGATGCAGTTGGAAATYCCTCCCAGGCGCATCATGATGCo
[0019] 更优选地，所述第一条链的序列为 GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTCGGGCTAGCCC。
[0020] 优选地，所述EMSA探针包含与第一条链探针互补的第二条链。
[0021] 一种EMSA探针的制备方法，包含W下步骤：
[0022] 合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列 和位于其5'及3'端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核巧酸序列与接头 序列的核巧酸序列相同；采用该引物W模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。
[0023] 优选地，所述PCR反应体系为：1μΜ模板链化L，10yM Biotin-LNA-Oligo化L，dNTP Mix 4]iL，DNA Polymerase 0.2扣L，10XPCR reaction buffer f5yL，d地2〇to 50μ1^;所述 PCR 反应条件为：94°C5min; 95°C10sec，55°C20sec，72°C8sec，35 循环；72°C10min。
[0024] 一种EMSA方法，使用上述EMSA探针进行EMSA。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0026] (1)不采用传统的两条单链探针复性得到双链探针的方法，而是由单链探针PCR制 得双链探针，不会出现由于复性不彻底造成的假阴性，也克服了单链自由探针带来的显影 误差；
[0027] (2)转录因子结合位点一般具有核巧酸序列多态性，传统方法制备EMSA探针时需 要分开合成互补探针并分开退火，成本高，操作繁琐;而本发明探针制备方法在保证碱基互 补配对的基础上，通过设计合成简并碱基模板可W制备多类型探针组，大大降低了探针的 制备成本，简化了制备过程；
[0028] (3)与需要合成大量单链探针、每个单链探针都需要进行生物素标记的现有技术 相比，本发明仅需合成少量单链探针和生物素标记的引物，大大降低了成本，缩短了标记时 间，对于EMSA在生产、研发中的应用及临床疾病检测上的运用具有非常重要的意义。
【附图说明】
[0029] 图1为EMSA探针中第一条链的结构示意图。
[0030] 图2为实施例1的EMSA探针电泳图。
[0031 ]图3为实施例1的EMSA结果图。
[0032] 图4为对比例1的EMSA结果图。
[0033] 图5为实施例2的EMSA探针电泳图。
[0034] 图6为实施例2的EMSA结果图。
[00巧]图7为对比例2的EMSA结果图。
[0036] 图8为实施例3的EMSA探针电泳图。
[0037] 图9为实施例3的EMSA结果图。
[003引图10为对比例3的EMSA结果图。
[0039] 其中，P1为蛋白-探针-抗体超迁移条带，P2为蛋白-探针迁移条带，P3为自由探针 (未结合蛋白的探针)条带;Probe表示标记探针，NE表示目的转绿因子的核蛋白，WT Probe 表示未标记探针，Mut Probe表示未标记的突变探针，Anti-TF表示目的转录因子的特异抗 体。
【具体实施方式】
[0040] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再寶述。
[0041] 本发明中模板链中的转录因子结合序列是参考转录因子结合序列数据库 transcription factor binding site,TFBS)，包括TRANSFAC、JASPAR、町T)B、TR畑、TRED、 PAZAR、MAPPER等，区分物种特异性获得目的转录因子结合序列。具