清洗基于a蛋白的亲和色谱柱的方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供清洗A蛋白色谱柱的方法。而且，本发明设及清洗基于A蛋白的亲和色 谱柱的方法，所述亲和色谱柱采用的亲和色谱介质包含基于金黄色葡萄球菌 (Staphylococ州S aureus)蛋白的C结构域的配体。
【背景技术】
[0002] 本申请包含WASCII形式电子提交的序列表，并且其整体援引加入本文。2014年6 月3日创建的所述ASCII拷贝名为P13-136PCT_^. txt，大小为6，289字节。
[0003] 蛋白纯化的常规方法通常包括细胞培养方法，例如利用重组工程化的哺乳动物或 细菌细胞系产生所关注的蛋白，然后：（a)用于去除细胞和细胞碎片的澄清步骤，例如利用 差速离屯、和/或过滤；W及(b)-个或多个下游色谱步骤W分离所关注的蛋白与澄清的细胞 培养进料中的各种杂质。
[0004] 在单克隆抗体和其他包含Fc的蛋白的情况下，纯化的行业标准通常包括多步过 程。重要步骤之一是纯化步骤，其采用称作A蛋白的结合抗体的Fc区的亲和配体。通常，在运 个步骤中去除大百分比的杂质。虽然，在抗体的纯化中A蛋白亲和色谱是非常有效的步骤， 但是使用A蛋白的一个缺点是与离子交换树脂相比其非常昂贵。亲和色谱柱的进一步包装 和解包也是非常劳动密集型的，并且带来显著的缓冲液成本。因此，能够清洗、重复使用并 消毒A蛋白柱几个循环是可取的。
[000引目前，利用碱性条件或酸性条件清洗采用大多数可商购的A蛋白介质的色谱柱。例 如，利用碱性溶液如氨氧化钢清洗采用MabSe 1 eCtS雌'6敏（GE)、KanCap A化aneka)和 ToyoPea讨愈AF-rProtein A 650F(Tosoh)介质的色谱柱，然而，采用 ProS.ep愈Ultra Plus介质化MD Millipore Co巧oration)的色谱柱使用酸性溶液用于清洗。
【发明内容】
[0006] 本发明提供清洗色谱柱的方法，所述色谱柱采用包含固定在固体支持物上的基于 金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的配体的介质，其中所述柱可W利用酸性和碱性两种溶液 清洗。
[0007] 如上文讨论的，由于A蛋白配体或基底基质对延长暴露于酸性或碱性溶液的不稳 定性，可W利用酸性溶液或碱性溶液清洗采用大多数可商购的A蛋白介质的色谱柱。相应地 建立采用运样的色谱柱的纯化方法，W便适应仅在碱性条件下清洗或仅在酸性条件下清 洗。
[0008] 本发明的方法使得除了在碱性条件下清洗W外或作为在碱性条件下清洗的替代， 能够在酸性条件下清洗采用包含固定在固体支持物上的基于A蛋白的C结构域的配体的介 质的色谱柱，从而提供更大的操作灵活性。通过使得能够高效清洗采用运样的介质的色谱 柱，本文所述的方法能够在许多循环中保留柱的结合能力。此外，通过使得能够清洗采用运 样的介质的色谱柱，与单独利用碱性条件或酸性条件清洗相比，实现更大的杂质去除，从而 导致更大的产物纯度。
[0009] 在一些实施方案中，提供一种经历一个或多个亲和纯化循环后仍保留亲和色谱柱 的结合能力的方法，所述方法包括在一个或多个亲和纯化循环之后用抑低于3.0的酸性溶 液清洗所述色谱柱，其中所述亲和色谱柱包含运样的介质，所述介质包含固定在固体支持 物上的源自金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的A蛋白配体，所述固体支持物包含选自W下 的聚合物:聚乙締酸、聚乙締醇、聚甲基丙締酸醋、聚丙締酸醋、聚苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲 基丙締酷胺和聚碳酸醋。
[0010] 在一些其他实施方案中，提供一种利用酸性和碱性两种溶液清洗亲和色谱柱的方 法，其中所述方法包括：（a)循环之后使所述柱与酸性和碱性两种溶液接触;或者(b)循环之 后使所述柱与酸性溶液接触或循环之后使所述柱与碱性溶液接触，从而所述酸性和碱性溶 液W交替方式使用，其中所述亲和色谱柱包含运样的介质，所述介质包含固定在固体支持 物上的源自金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域的A蛋白配体。
[0011] 在一些实施方案中，所述A蛋白配体包含选自SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4的氨基 酸序列。
[0012] 在一些实施方案中，所述固体支持物包含选自W下的聚合物：聚乙締酸、聚乙締 醇、聚甲基丙締酸醋、聚丙締酸醋、聚苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲基丙締酷胺和聚碳酸醋。在 一具体实施方案中，所述固体支持物包含聚乙締酸聚合物。
[0013] 在一些实施方案中，所述酸性溶液的pH为1.5，或pH为2.0，或pH为2.5。
[0014] 在一些实施方案中，所述结合能力在经历10个或更多个循环后仍得W保留。在其 他实施方案中，所述结合能力在经历50个或更多个循环后仍得W保留。在其他实施方案中， 所述结合能力在经历100个或更多个循环后仍得W保留。在其他实施方案中，所述结合能力 在经历200个或更多个循环后仍得W保留。
[0015] 本文还提供一种在使用之后消毒亲和色谱柱同时保持所述柱的结合能力的方法， 其中所述方法包括使所述亲和色谱柱与包含憐酸、乙酸和苯甲醇的溶液接触至少3小时，并 且其中所述亲和色谱柱包含固定在固体支持物上的源自金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域 的A蛋白配体，所述固体支持物选自聚乙締酸、聚乙締醇、聚甲基丙締酸醋、聚丙締酸醋、聚 苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲基丙締酷胺和聚碳酸醋。
【附图说明】
[0016] 图1为示出实验结果的条形图，所述实验在暴露于W下溶液时测量树脂A、B和C保 留的静态结合能力百分比：（1)0.3%盐酸，pH 1.5:(2)0.15M憐酸，pH 1.5:(3)0.1M化0H; 和(4)0.5M NaOH，暴露25虹，运等于100个循环（W 15min/循环）。全部3个树脂样品均证实相 对于对照，在暴露于0.3%肥1和0.151出斷4时，2化'暴露之后保留超过95%结合能力。相对 于对照，树脂A和B在暴露于0.1M化0H时保留超过95%结合能力。相对于对照，树脂A和B在 暴露于0.5M NaOH时保留约75%结合能力。相对于对照，树脂C在暴露于0.1M化0邸寸保留约 65%结合能力。相对于对照，树脂C在暴露于0.5M化0H时保留约38%结合能力。标准差为约 3%。
[0017] 图2为示出实验结果的条形图，所述实验测量树脂B暴露于W下的100和200个循环 之后保留的动态结合能力百分比（在4min停留时间10%): (1)通过每10个循环交替0.1M 化OH和ο. 15M憐酸，pH 1.5清洗；（2)仅用憐酸清洗；W及(3)仅用ο . IM化OH碱性溶液清洗。 交替暴露于憐酸和化0H和0.15M H3PO4200 个循环（15min/循环）之后；仅暴露于0.15M 出P04200个循环（15min/循环)之后，或者暴露于0.1M化0H 200个循环（15min/循环)之后未 观察到动态结合能力的显著变化(10%突破）。标准差为约10%。
【具体实施方式】
[0018] A蛋白亲和色谱包括包含Fc的蛋白（例如，免疫球蛋白或另一Fc-融合蛋白）结合至 包装在柱中的A蛋白树脂或介质（即，固定在固体支持物上的A蛋白配体），随后从柱洗脱包 含Fc的蛋白。原位清洗(CIP)对于色谱柱的高效使用W及最大化柱可W重复使用的循环数 至关重要。一般需要有效去除杂质且对色谱树脂无害的清洗方法。通常用于大多数可商购 的A蛋白树脂的清洗W及消毒的最常见的清洗溶液之一是氨氧化钢（NaOH)(参见例如， Hagel L et.al.Handbook of Process Chromatography-Development.Manufacturing, Validation and Economics . Second edition.London,UK:Academic Press ； 2008.Cleaning and Sanitization;pp.147-159;Gronberg et al.,MAbs.2011Mar-Apr;3 (2): 192-202)。通常，当W柱模式进行许多随后的循环时，在色谱柱上可能存在污染物的逐 渐积累，引起柱的污染W及柱的效率和结合能力降低。循环之间的高效清洗方法最小化色 谱柱上的污染物积累，从而延长柱的寿命。运也称作柱再生。
[0019] 虽然利用碱性溶液如氨氧化钢清洗大多数可商购的A蛋白树脂，但是利用憐酸 (也P〇4)清洗ProSep?叫tra Plus树脂（EMD Millipore Corporation)。
[0020] 本发明至少是基于令人惊讶和出乎意料的发现，可W用酸性和碱性两种溶液清洗 采用介质的色谱柱，所述介质包含固定在固体支持物上的基于金黄色葡萄球菌A蛋白的C结 构域的配体。通过使得能够用酸性和碱性两种溶液清洗柱，不仅获得更大的操作灵活性，而 且在纯化过程中使用碱性和酸性两种溶液清洗时，获得更大的蛋白纯度。
[0021] 为了可W更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明 书中示出。
[0022] I.定义
[0023] 如本文所用，术语"SpA"、"A蛋白"或"金黄色葡萄球菌A蛋白"指分离自细菌金黄色 葡萄球菌的42kDa多结构域蛋白。SpA通过其称作X结构域的簇基端细胞壁结合区结合至细 菌细胞壁。在氨基端区，其包括5个免疫球蛋白结合结构域，称作E、D、A、B和C(Sjo化al，Eur J Biochem.Sep78(2) :471-90(1977) ;Uhlen et al.J Biol ChemJeb 259(3):1695-702 (1984))。运些结构域每个均包含约58个氨基酸残基，并且它们享有65-90%氨基酸相同性。
[0024] SpA的E、D、A、B和C结构域每个均具有不同的Ig-结合位点。一个位点是对化（Ig的 IgG类别的恒定区），而另一个是对某些Ig分子的化b部分(负责抗原识别的Ig部分）。已报道 每个结构域均包含化b结合位点。SpA的非Ig结合部分位于C-端，并且命名为X区或X-结构 域。
[002引在本文中可交换使用的术语乂结构域"、"SpA的C结构域"、"A蛋白的C结构域"和 "金黄色葡萄球菌（51日911710(30(3(3113日11'6113)4蛋白的(：结构域"指其氨基酸序列在560 10 N0:1中示出或由例如SEQ ID N0:2示出的核巧酸序列编码的多肤。乂结构域"是折叠为Ξ螺 旋束结构的58个氨基酸多肤。其能够通过螺旋1和2表面上的残基结合Fc，或者通过螺旋2和 3表面上的残基结合化b。
[0026] 如本文所述方法中使用的基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体包括具有与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列至少80%、或至少85 %、或至少90 %或至少95 %或更多相同的氨基酸 序列的配体。
[0027] 在各种实施方案中，用于本文所述方法的基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体包含 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0028] 如本文所用，术语"色谱"指一种动态分离技术，其将祀分子如祀蛋白（例如，免疫 球蛋白或另一包含Fc的蛋白）与混合物中的其他分子分开并允许将其分离。通常，在色谱方 法中，流动相(液体或气体)运送包含所关注的祀分子的样品穿过或通过固定相(通常为固 体)介质。对固定相