一种新型pH响应双发射波长荧光分子探针的合成方法及其在生物成像中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种响应双发射波长荧光分子探针的合成方法及其在生物成像中的 应用。特别是一种新型基于聚集诱导发光原理设计的荧光探针。
【背景技术】
[0002] 细胞内pH( pHi)是监测细胞行为的一个参数，例如细胞分裂、细胞凋亡、离子传输、 酶活性以及蛋白质降解等。在典型的哺乳动物细胞中，线粒体内的pH值约为8.0,细胞质和 细胞核的pH值为7.2-7.4，溶酶体的pH值沿着细胞内吞途径从6.3变化到4.7。细胞功能紊乱 经常与反常的细胞器内pH值相关。反常的pH,是许多常见疾病发生的指标，例如癌症、中风 和阿茨海默病（R. A.Gottlieb，J.Nordberg，E· Skowronski and Β·Μ·Babior，PNAS，1996， 93,654;D.P0rez-Sala，D.Collado_Escobar and F.Mollinedo，J.Biol.Chem.，1995,270， 6235)。监测活细胞内的pH值变化对于研究细胞新陈代谢和了解生理学及病变等过程具有 重要意义。
[0003] 检测pHi的方法有微电极、核磁共振法和光学显微镜法等。相比于其它方法，荧光 光谱法由于其具有独特的高选择性、高灵敏、高时间空间分辨率等特点，成为监测细胞内pH 值变化的首选方法。因此合成具有pH响应功能的荧光探针分子也因此成为一个热门的研究 领域。
[0004] 目前，pH响应的荧光探针分子的设计大多数都是基于光诱导电子转移（photo induced electron transfer, PET)、激发态分子间质子转移（excited state intramolecular proton transfer，ESIPT)、焚光共振能量车专移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)等原理(M· Yang，Y · Song，M· Zhang，S · Lin，Z · Hao，Y· Liang，D · Zhang and P.R. Chen，Angew.Chem.Int.Ed.，2012,51，7674;S.Modi，M.Swetha，D.Goswami， G. D.Gupta,S.Mayor and Y.Krishnan,Nature Nanotechnology,2009J4J325；R.C.Somers, R.M.Lanning,P.T.Snee,A.B.Greytak,R.K.Jain,M.G.Bawendi and D.G.Nocera,Chemical Science，2012,3,2980;I.L.Medintz，M.H.Stewart，S·A·Tramme11，K·Susumu， J.B.DelehantyjB.C.MeijJ.S.MelingerjJ.B.Blanco-Canosa ,P.E. Dawson and H. Mattoussi,Nature materials,2010,9,676；K.Zhou,Y.Wang,X.Huang,K.Luby-Phelps, B.D .Sumer and J .Gao，Angew. Chem. Int.Ed.，2011，50,6109.) D大多数焚光探针分子的焚 光强度随pH变化的单一波长的强度发生变化，而且合成方法相对复杂。因此，发展其它途径 设计合成方法简便、具有pH响应双发射波长、毒性小、稳定性较好、能应用于生物荧光成像 的pH响应荧光探针分子具有重要的意义。
[0005] 2001年，一种名为Silole的化合物在溶液状态下发光很弱，当向溶液中加入非溶 剂后，体系变浑浊，同时荧光强度急剧增大，荧光量子效率显著升高，这种现象与传统的聚 集导致荧光猝灭恰好相反，他们将这种现象称为聚集诱导发光现象通过实验和理论计算表 明，产生聚集诱导发光现象的主要原因是分子在溶液状态下由于分子内转动导致的非辐射 能量衰减在聚集状态下得到了抑制，化合物的激发态主要以辐射发光的方式进行衰减，从 而使分子的发光效率大大增强。聚集诱导发光现象的发现改变了人们对荧光探针的认识， 为设计荧光探针分子及其在分析检测领域中的应用提供了新的思路(Y.Hong，J.W.Lam and B.Z.Tang，Chem.Soc.Rev.，2011，40,5361;Y.Yuan，C.J.Zhang and B . Liu , Angew.Chem.Int.Ed.,2015,54,11419；X.Xue,Y. Zhao,L. Dai,X.Zhang,X.Hao,C. Zhang, S.HuojJ.LiUjC.LiUjA.Kumarjff.Q.CherijG.Zou and X.J.Liang,Adv.Mater.,2014,26, 712·)。
[0006] 具有聚集诱导发光特性的分子作为荧光探针在分析检测领域有着普通荧光探针 不可比拟的优点，首先具有聚集诱导发光性能的探针分子其在聚集状态不会发生荧光猝 灭，减小了探针浓度对检测结果的影响;在生化分析检测过程中，聚集诱导发光分子允许结 合到生物大分子上的分子数目可以比传统荧光探针多很多，相应的荧光强度的更大，因此 可以获得更高的灵敏度;再次，聚集诱导发光荧光探针采用的是一种turn-on的原理，其灵 敏度相对较高（2丄11〇，父.丫11&11，￥.￥11，( >).211&叫，0.1'.1^〇1^，]\￥.1^6 311(1]\父16， J.Am.Chem.Soc.,2012,134,16662；X.Jia,J.Li and E.Wang,Small,2013,9,3873；M.Wang, X.Gu,G.Zhang,D.Zhang and D.Zhu,Anal.Chem.,2009,81,4444；X.Li,K.Ma,S.Zhu,S.Yao, Z.Liu,B.Xu,B.Yang and W.Tian,Anal .Chem. ,2014,86,298;)。由于具有以上特性，成为近 十年来荧光分析方法的研究热点。聚集诱导发光现象的发现为设计新型荧光探针分子提供 了一种可能的途径。
【发明内容】
[0007] 本发明是要解决上述现有的检测?出方法存在的问题，从而提供了一种新型pH双 响应的荧光分子探针及其合成方法。
[0008] 本发明所述的pH响应探针分子是具有聚集诱导发光活性的化合物分子。
[0009] 在酸性条件下，由于具有聚集诱导发光活性的分子内部中含有较多疏水性的结 构，自身发生聚集，这种聚集使得分子内转动的非辐射能量衰减得到抑制，产生聚集诱导发 光引起的橙色荧光;而在碱性条件下，其结构中的羧基和羟基上的质子发生解离，探针处于 离子状态，共辄作用增强，产生绿色的荧光。
[0010] 本发明所述的一种pH响应双发射波长的荧光分子探针，pH响应双发射波长的荧光 分子，其中文名为:4,4'-((把，把'）-酰肼-1，2-二亚基二（甲基亚基））二(2-羟基苯甲酸）； 英文名称为:4,4'_((IE，1 'Ephydrazine-l，2-diylidene bis(methanylylidene) )bis(2-hydroxybenzoic acid)，简称为HDBB，其结构式为：
[0012]上述pH响应双波长响应的荧光分子探针的合成方法是按以下步骤进行：
[0014] 1)将4-醛基-3-羟基苯甲酸（0.1668，1.〇1111]1〇1)溶于51111^甲醇中，加入80%水合肼 (24yL，0.5mmol)，搅拌回流 12h。
[0015] 2)离心分离并用甲醇洗三遍，得到淡黄色产物。
[0016]由以上可知，合成发明所述的HDBB荧光分子探针只需一步缩合反应，合成方法较 简便，易于分离纯化。其产率为73.5%。通过核磁和质谱证明反应所得到的淡黄色产物与 HDBB分子的结构相符合。咕 NMR(500MHz，DMS0-d6)，δ(TMS，ppm): 8 · 93(s，2H)，7 · 60(d，2H)， 7.39(d,2H),7.38(s,2H).13C NMR(125MHz,DMS〇-d6),δ(TMS,ppm):170.2,163.5,158.6, 144.0,131.1，121.2，119.7，117.6.质谱：理论计算(：161112%〇6[]?+!1]+329.0729，质谱图中 329.0767(高分辨）.
【附图说明】
[0017]图1 HDBB分子在不同比率的二甲亚砜和甲醇混合溶剂中的发射谱图。
[0018]图2为本发明实施例3采集到本发明聚集诱导发分子的荧光-pH响应谱图。其中即 不同pH值下本发明的发射谱图，c = 2.5X 10-5M(ex = 360nm)〇
[0019]图3为本发明实施例3采集到I59Q/l49『pH曲线图，其中I 59Q和I·分别指代本发明聚 集诱导发光分子溶液在590、490nm处的荧光强度(eX = 360nm)〇
[0020] 图4为本发明实施例1采集到(A).本发明聚集诱导发光分子、溶酶体追踪器分别对 溶酶体的染色情况的共聚焦图像，以及将前二者叠加进行比对后获得的图像。