抗逆相关基因ZmHDZIV14在调控植物抗逆性中的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种增强植物抗旱抗逆性的基因；本发明还涉及所述基因在改良植物 对干旱胁迫抗性方面的应用方法。
【背景技术】
[0002] 同源异型域-亮氨酸拉链(HD-Zip)是植物所特有的一类转录因子，广泛存在于多 种植物中，不仅在高等植物生长发育、形态建成中发挥重要作用，同时调控植物对生物和非 生物胁迫等逆境的响应过程。拟南芥中的AtHDGll基因编码一个属于HD-ZipIV类家族的转 录因子，该基因的表达可促进根的伸长和气孔关闭从而提高植物耐旱性，已有的研究表明 转AtHDGll基因的拟南芥、烟草和草坪草均表现出较强的耐旱性。目前已经鉴定出玉米HD-Zip IV类转录因子基因 17个，进化分析表明ZmHDZIV14基因与AtHDGll基因的同源性较高， 推测这两个基因与AtHDGll基因有相似的功能。但是目前对于玉米HD-Zip IV基因家族的研 究还较少，主要是其在植物不同组织的表达模式和在植物外表皮及毛状根发育过程中的研 究，其生理功能特别是在环境胁迫中的生理功能还未见报道。本研究根据NCBI数据库中与 AtHDGll基因同源的玉米HD-Zip IV基因 ZmHDZIV14的cDNA序列。研究了ZmHDZIV14基因克 隆，生物信息学分析及植物表达载体构建，并将这个基因转入植物，从而快速获得具有抗逆 性状的转基因植物。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种增强植物抗逆相关蛋白及其编码基因；本发明的第二目 的是提供一种增强植物抗逆相关蛋白及其编码基因的应用方法。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种增强植物抗逆相关蛋白，名称 为ZmHDZIV14,来源于玉米(Zea mays L.)自交系B73,是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋 白质： (1) 序列表中SEQ ID:2; (2) 序列表中SEQ ID:2的氨基酸残基序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗逆相关的蛋白质。
[0005] 其中，序列SEQ ID:2由692个氨基酸残基组成。
[0006] 所述一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基 酸的取代和/或缺失和/或添加。氨基酸优先取代如表1所示。
[0007]
上述ZmHDZIV14增强植物抗逆相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0008] 上述ZmHDZIV14增强植物抗逆相关蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一： (1) 序列表中SEQ ID NO: 1的核苷酸序列； (2) 编码序列表中SEQ ID N0:2蛋白质序列的DNA; (3) 与序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列具有90%以上同源性，切编码相同功能蛋白质的 DNA序列； (4) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO: 1限制的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0009] 上述高严谨条件为在0.1 X SSC，0.1 X SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜;其中， 序列表中的SEQ ID NO: 1由2079个脱氧核苷酸组成。
[0010] 含本发明基因的重组表达载体、转基因细胞及工程均属于本发明的保护范围。
[0011] 本发明的第二目的是通过以下技术方案来实现的：一种增强植物抗逆相关蛋白的 编码基因的应用方法;其特征在于:将携带有本发明的ZmHDZIV14基因的表达载体，通过使 用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物方法 转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗旱抗逆性提高的植株。
[0012] 本发明的ZmHDZIV14基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其 转录超始核苷酸前加包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、 发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对ZmHDZIV14基因植物细胞或植 物进行鉴定及筛选，可对所使的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(bar基因、GUS基 因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生物素标记物(庆大霉素、卡那霉素等）。被转化的植 物宿主既可以是单子叶植物，也可以使双子叶植物，如:水稻、小麦、玉米、烟草、拟南芥等。
[0013] 携带有本发明的ZmHDZIV14基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒 载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物方法转化植物细胞或组织，并将 转化的植物经组织培育成植株，获得抗逆性提高的植株。
[0014] 实验证明，在逆境条件下，转ZmHDZIV14拟南芥比野生型拟南芥具有较强的抗旱 性。在干旱胁迫条件下，转基因拟南芥存活率、生物量和相对含水量均高于非转基因植株， 同时脯氨酸含量得到提高，丙二醛含量降低。
[0015] 将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因按常规方法转入其他植物中，可增强 植物的抗旱性。
【附图说明】
[0016] 图1为玉米ZmHDZIV14基因全长PCR扩增产物； 图2为载体pUCm-T-ZmHDZIV14的酶切鉴定； 图3 为载体 pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV14-bar 的酶切鉴定； 图4为6个限制性酶BamH I、EcoR I、Hind III、Sma I、Xba I、Sac I消化拟南芥基因组 的对比图； 图5为玉米和拟南芥HD-Zip IV型转录因子基因编码蛋白的进化分析； 图6为玉米ZmHDZIV14和拟南芥AtHDGll基因编码蛋白序列的同源性比较； 图7为植株表达载体PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV14-bar的构建过程； 图8为玉米ZmHDZIV14基因转基因拟南芥获取过程(A表示野生拟南芥种植;B表示花 序侵染后拟南芥;C表示T0代混收种子;D表示T1代抗性苗;E表示T2代抗性苗;F表示T3代抗 性苗）； 图9为转基因拟南芥的PCR鉴定(M为DNA Marker D5000; CK+为阳性对照;CK一为阴性对 照；1-10为抗性植株）； 图10为部分经PCR检测的阳性转基因拟南芥植株的Northern blot分析结果，杂交结果 表明SEQ ID NO: 1核苷酸序列能在转基因拟南芥中表达； 图11为20%PEG对ZmHDZIV14转基因拟南芥幼苗生长的影响； 图12为20%PEG胁迫下ZmHDZIV14转基因拟南芥存活率的影响； 图13为20%PEG胁迫下ZmHDZIV14转基因拟南芥生物量的影响； 图14为20%PEG胁迫下ZmHDZIV14转基因拟南芥相对含水量的影响； 图15为20%PEG胁迫下ZmHDZIV14转基因拟南芥和野生拟南芥中丙二醛含量； 图16为20%PEG胁迫下ZmHDZIV14转基因拟南芥和野生拟南芥中脯氨酸含量。
【具体实施方式】
[0017] 下述实施中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0018] 实施例l、ZmHDZIV14蛋白及其编码基因的获得 野生型拟南芥(Arabidopsis 1:1^1丨31^，(]〇1)种子为甘肃省干旱生境作物学玉米重点 实验室保存。
[0019] 菌株：大肠杆菌（Eschrichiacoli) DH5a，用于拟南芥遗传转化的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)为LBA4404,两个菌株均为甘肃省干旱生境作物学玉米重点 实验室保存。
[0020] 质粒：T/A克隆载体pUCm-T购自生工生物工程（上海）有限公司，植物表达载体 PCAMBIA3300-35S-PR0II MCS-bar为甘肃省干旱生境作物学玉米重点实验室改造，卡那抗 性用于T/A克隆。
[0021 ] 实施例1;SEQ ID N0:2蛋白及其编码基因的获得 菌株：大肠杆菌（Eschrichiacoli) DH5a，用于烟草遗传转化的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)为LBA4404,两个菌株均为甘肃省干旱生境作物学玉米重点 实验室保存。
[0022]质粒：T/A克隆载体pUCm-T购自生工生物工程（上海）有限公司，植物表达载体 PCAMBIA3300-35S-PR0II MCS-bar为本实验自己改造，卡那抗性用于T/A克隆。
[0023] 一、核苷酸序列SEQ ID NO: 1的克隆步骤如下： (一)玉米总RNA的提取与纯化 玉米RNA的提取(Trizol法）： 实验前准备工作:DEPC水的配置：1L水中加入lml的DEPC(DEPC体积份数是0.1%)，37°C 温浴12h。高压灭菌至少20min，灭菌2次，使DEPC彻底失活。PCR管，1.5ml离心管，2ml离心管， 各种枪头等用DEPC水(未灭菌)浸泡，37°C过夜，次日灭菌备用。
[0024] 试剂:trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇(DEPC水配