一种透明质酸奇数寡糖单体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种透明质酸奇数寡糖单体及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄 糖醛酸(GlcA)二糖重复单位通过β-(1-4)糖苷键和β-(1-3)糖苷键构成的无分支结构的 高分子酸性黏多糖，广泛分布于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。随着国内外对ΗΑ 的分布、化学结构及理化性质等方面研究的不断深入，发现ΗΑ有多种生物功能，如参与肺和 血管疾病及胚胎形成的信号传导，伤口愈合等，使其在食品、医药及化妆品等领域有广泛而 独特的应用价值。研究也发现，ΗΑ发挥生理作用与其分子量的大小密切相关，低分子量ΗΑ 寡糖促进血管生成，而高分子量ΗΑ则抑制血管生成。ΗΑ寡糖作为拮抗剂可与CD44受体结 合，加速CD44的裂解，从而减弱了耐药作用，抑制肿瘤的耐药性。ΗΑ寡糖通过促进肿瘤抑制 基因（ΡΤΕΝ)的表达，抑制ΡΙ3Κ/ΑΚΤ信号传导通路而抑制肿瘤细胞的生长。此外，ΗΑ寡糖可 以促进创伤愈合、诱导巨噬细胞表达多种趋化因子。
[0003] 研究发现，寡糖与蛋白质等生物分子作用发挥生理功能的过程中，寡糖的聚合度 以及还原端或非还原端糖残基的种类与其活性密切相关。因此，制备结构新颖、聚合度明确 的透明质酸寡糖，对于透明质酸寡糖构效关系的研究，发现透明质酸寡糖新的活性与作用 方式具有重要的意义。
[0004] 目前公开的低分子量透明质酸的制备方法主要有酶解法、物理法和化学法。其中 以酶法制备低分子量透明质酸最多，中国专利申请（公布号：CN 102690847 Α， CN101294179A，CN 102876748 A，CN 103255187 A，CN 104178539 A，CN101020724A)公开了 酶法制备低分子量的方法。中国专利申请(公布号:CN104059166A，CN103993022A)公开了从 透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法。化学方法制备透明质酸也有报道，中国专利申 请（公布号:CN102174122A，公开号:CN1563108A)利用透明质酸热和酸不稳定特性，制备低 分子量透明质酸。中国专利申请（公布号:CN102850467A)公开了在有机溶剂中碱催化制备 低分子量透明质酸的方法。中国专利申请（公开号:CN101429255A)公开了在有机溶剂中酸 催化制备低分子透明质酸钠的方法。机械方法制备低分子量透明质酸的报道有，中国专利 申请（公布号:CN101942037A)公开了机械研磨法制备分子量低于1万的低分子量透明质酸 的方法。中国专利申请（公布号:CN102630231A)公开了利用活性炭分解制备低分子量透明 质酸的方法。这些方法所制备的低分子量透明质酸均为混合物，分子量分布范围宽，结构不 明确。虽然中国专利申请（公布号：CN102304193A)公开了酸性溶液中制备聚合度为1-4的 透明质酸寡糖方法，但该方法制备的透明质酸寡糖结构不明确，且寡糖聚合度小，应用范围 受到限制。中国专利申请（公布号:CN103484513A)利用水蛭来源的透明质酸酶制备四糖、 六糖、八糖和十糖的方法，该方法制备的透明质酸寡糖聚合度为偶数，且其寡糖结构序列不 清楚。因此，通过简单工艺、规模化制备特定分子量、结构明确的系列奇数透明质酸寡糖单 体的方法仍未见相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对目前透明质酸寡糖单体制备中存在的问题，本发明的目的是提供一种透明质 酸奇数寡糖单体及其酸降解制备方法，它能弥补现有技术中的上述不足。本发明为解决制 备特定奇数聚合度的新的透明质酸寡糖，采用稀酸或固相酸水解，结合低压凝胶色谱一次 分离制备系列透明质酸寡糖，且产品结构明确、无杂质残留，容易实现产业化。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现： 一种透明质酸奇数寡糖单体，它的结构通式如下所示：
其中所述结构式中n=0~10，R=H或Na或K或NH4，所述透明质酸奇数寡糖单体的还原端 和非还原端均为葡萄糖醛酸或葡萄糖醛酸的金属盐或铵盐。
[0007] 本发明还提供了所述的透明质酸奇数寡糖单体的制备方法，它包括以下步骤： (1) 酸降解:将分子量为50~lOOOkDa的高分子量透明质酸水溶液在加热搅拌下用稀 酸降解或用氢型阳离子交换树脂降解，所述稀酸的体积比用量为透明质酸质量的5~20倍， 所述氢型阳离子交换树脂的质量为透明质酸质量的1~5倍，过滤，滤液冷却后用碱中和，浓 缩，加入有机溶剂沉淀，离心后上清液减压浓缩得到酸水解寡糖混合物； (2) 凝胶柱分离:将步骤(1)所述酸水解寡糖混合物用低压凝胶色谱柱分离，以盐溶液 为洗脱剂，示差检测器在线检测，按照洗脱峰收集，分别减压真空浓缩后冷冻干燥，得不同 聚合度的透明质酸奇数寡糖单体。
[0008] 进一步的：所述步骤（1)中酸降解时高分子量透明质酸溶于水的质量体积比浓度 为5%~20%。
[0009] 进一步的:所述步骤(1)中酸降解的温度为50°C~100°C，反应时间0.5h~12h。
[0010] 进一步的：所述步骤（1)中稀酸为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、柠檬酸或三 氟乙酸中的至少一种，所述稀酸的终浓度为0. 〇lmol/L~2. Omol/L。
[0011] 进一步的：所述步骤（1)中氢型阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树 脂。
[0012] 进一步的:所述步骤(1)中碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化铵 中的至少一种。
[0013] 进一步的:所述步骤(1)中有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮，有机溶剂的体积 比终浓度为30%~80%。
[0014] 进一步的：所述步骤(2)中低压凝胶色谱柱填料为Superdex 30、Bio Gel P10、Bio Gel P6或Bio Gel P4。
[0015] 进一步的:所述步骤(2)中洗脱剂为0.05mol/L~0.5mol/L碳酸氢铵或醋酸铵的水 溶液。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是： (1)本发明采用凝胶柱色谱分离制备透明质酸寡糖单体，一次分离即可获得聚合度3 ~23的透明质酸奇数寡糖单体，无需再用离子交换色谱法进一步分离，极大的简化了工艺 操作，提高了寡糖单体制备的效率。
[0017] (2)本发明采用碳酸氢铵或醋酸铵为洗脱液凝胶柱分离制备透明质酸奇数寡糖 单体，所获寡糖单体经过反复减压浓缩或冷冻干燥即可除去流动相中的盐，克服了寡糖单 体尤其是低聚合度寡糖单体脱盐困难的问题，提高了产品的品质。
[0018] (3)本发明制备的透明质酸寡糖聚合度均为奇数，填补了透明质酸奇数寡糖制备 的空白，且所制备的寡糖还原端与非还原端均为GlcA，用于透明质酸寡糖构效关系的研究 具有明显的优势。
[0019] (4)本发明制备的透明质酸奇数寡糖单体结构新颖，性质稳定，可用于制备寡糖 标准试剂，或作为生物活性物质或中间体进一步制备成寡糖保健品或寡糖药物。
[0020] (5)本发明提供的透明质酸奇数寡糖单体具有制备工艺简单，无害，无污染，容易 产业化的特点。
[0021] 结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其它优点和特点将变得更加清 晰。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明制备透明质酸奇数寡糖单体的低压凝胶柱色谱分离图。
[0023]图2为本发明制备透明质酸三糖的ESI/MS质谱图。
[0024]图3为本发明制备透明质酸五糖的ESI/MS质谱图。
[0025] 图4为本发明制备透明质酸七糖的ESI/MS质谱图。
[0026] 图5为本发明制备透明质酸九糖的ESI/MS质谱图。
[0027]图6为本发明制备透明质酸^^一糖的ESI/MS质谱图。
[0028]图7为本发明制备透明质酸十三糖的ESI/MS质谱图。
[0029]图8为本发明制备透明质酸十五糖的ESI/MS质谱图。
【具体实施方式】
[0030]下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明。
[0031]实施例1:透明质酸奇数寡糖单体稀酸降解制备 本实施例所述透明质酸奇数寡糖单体的稀酸降解制备方法包括以下步骤： 1、取分子量为600 kDa透明质酸75g加入1500mL蒸馏水中加热搅拌使其完全溶解，加硫 酸使其终浓度达到〇.〇lmol/L~2mol/L(本发明中稀酸加入的体积单位为mL，透明质酸质量 的单位为g)，60°C~100°C水浴搅拌水解0.5h~5h，反应结束后将反应液冷却至室温，用氢 氧化钠调节溶液pH值至中性，加入3倍体积乙醇后离心分离，上清液减压真空浓缩，冷冻干 燥后得透明质酸寡糖混合物。
[0032] 2、取所述寡糖混合物加水溶解后用Superdex 30凝胶色谱柱分离，以0.3 mol/L醋 酸铵为洗脱液，示差检测器在线检测，根据洗脱峰合并收集，减压浓缩后冷冻干燥获得不同 聚合度透明质酸寡糖单体。
[0033]本实施例所述的硫酸可改用盐酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、柠檬酸或三氟乙酸;所 述的氢氧化钠可改用氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化铵;所述的乙醇可改用甲醇、丙 酮或异丙醇;所述的Superdex 30凝胶填料可改用Bio Gel P10，Bio Gel P6或Bio Gel P4; 所述的〇. 3mol/L醋酸铵洗脱液可改用水或0.05