一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及复合酶，具体涉及一种含酸性蛋白酶的酒精复合酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 生产酒精的原料主要是玉米、小麦等粮食作物和红薯（干）、木薯（干）、甘蔗糖 蜜（桔水）等非粮食作物。在这些植物的果实或根茎里，除了一定量的淀粉多糖外，还有部 分非淀粉多糖、果胶、蛋白质、灰份、维生素和生物素等。酒精工厂在对原料进行液化、糖化 时使用的高温α -淀粉酶和糖化酶，可以对淀粉多糖进行高效率的转化，但对于非淀粉多 糖、果胶、蛋白质、灰份等物质却无法水解，要靠发酵时酵母自身分泌的内源酶来进行水解 利用。然而，由于作用环境因素和酵母本身的特点，这种分解是缓慢的、低效率的。现代酶 工程技术的发展为充分利用上述物质提供了可行的技术手段，酒精复合酶正是针对酒精生 产中存在的这些特点而设计的一款新型复合酶制剂。
[0003] 采用浓醪发酵生产酒精，可缩短发酵周期，降低能耗，提高设备利用率，是一种具 有巨大应用价值的酒精发酵技术，随着酶生产技术的成熟，国内外对浓醪发酵生产酒精的 研究从未停止。比如，大量研究表明，在玉米酒精浓醪发酵过程中分别添加适量植酸酶、酸 性蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶，可进一步提高酒精产量，增加原料出酒率。因此，研究开发 适于酒精生产的酒精复合酶是降低酒精生产成本的重要手段之一。在酒精浓醪发酵条件 下，为缩短发酵周期必须加快发酵速度，而玉米原料除含有大量淀粉外，还含有一定量的粗 纤维、粗蛋白和油脂，与淀粉颗粒紧密结合，影响淀粉水解速度。因此，添加适当酒精复合 酶，一方面可以进一步破坏原料结构，充分发挥糖化酶的作用，从而增加可发酵性糖，提高 原料出酒率；另一方面可以为酵母提供充足的氮源、脂肪酸等营养因子，促进酵母生长繁 殖，增加主发酵时酵母浓度，从而加快发酵速度，提高酵母酒精耐性。
[0004] 在近十年中，酒精生产技术取得了巨大的进步，使得该行业变得更有利可图。但 是，利润率仍然很低。细菌污染是酒精得率和品质下降的主要原因之一。为了能控制成本 效率，抑制酒精发酵中的细菌极其重要。在燃料乙醇的生产中，一般通过在发酵过程中添加 抗生素作为工艺助剂而达到此目的。目前，日益增长的对在农业和技术领域应用抗生素而 使病原菌产生抗生素多种抗性的关注，已产生了采用一种安全天然替代品的强烈要求。发 酵共产物为酒精厂的经济效率作出了重要的贡献。越来越多的酒精生产商因声称他们的发 酵共产物中不含有抗生素而得利。致力于促进可再生能源的生物乙醇生产商尤其受使用可 能导致环境危害的工艺助剂的争执所困扰。某些地区已实施了严格的规定，如2005年底， 在欧盟内被用于作为动物饲料的复合物，其发酵共产物不允许有抗生素残留。
[0005] 综上，在发酵工艺和方式确定后，提高酒精产量和质量的焦点问题是酒精复合酶 的应用和防止发酵过程杂菌（乳酸菌）的污染。中国专利CN 101245339 Β公开了一种可 替代酵母的营养盐和酒精及燃料乙醇专用糖化营养复合酶，培养的酵母健壮，酵母细胞数 多，酶活性强，同时酵母对数生长期长，抑制杂菌生长，降低酸度；缩短发酵时间；还增加可 发酵糖，可以提高原料的利用率，提高酒精度，给企业带来可观的经济效益。本发明涉及酒 精酵母营养复合酶，它的成分组成按重量份数比为：蛋白酶2 - 3份；植酸酶1 一 2份；淀 粉酶1 一 2份；纤维素酶2 - 3份；支链淀粉酶1 一 2份。本发明在使用时，只须在酒精 生产中按原料的0.5%。（W/W)撒入酒母培养罐的醪液中即可，操作工序简单。中国专利CN 103571878 A公开了一种用于菊芋粉发酵生产燃料乙醇的复合剂，它包含有：耐高温ct 一 淀粉酶8 - 10份；复合酶：糖化酶80 - 100份、普鲁兰酶30 - 40份、纤维素酶酶15 - 20 份、酸性蛋白酶8 - 15份、果胶酶15 - 25份、菊粉酶20 - 30份、β -葡聚糖酶5 - 10份、 β -甘露聚糖酶3 - 6份、木聚糖酶5 - 15份、植酸酶3 - 5份；耐高温酿酒干酵母80 - 90份。本发明的有益效果是：采用本复合剂进行发酵菊粉生产燃料酒精，操作简单、稳定性 好、发酵周期短、转化效率高、生产成本低等优点，对进一步实现利用菊芋发酵，大规模化生 产燃料乙醇具有一定的指导意义。上述公开专利的缺陷是：1)用于酒精生产的复合酶只是 简单的商品酶制剂的组合，酶系不全；2)没有解决复合酶制剂的酶活力及其存储稳定性的 问题，复合酶应用受限；3)没有从根本上解决防止杂菌污染导致酒精产量和质量下降的问 题。
[0006] 因此，制备一种酶系全、酶活力高、存储稳定、有效防止发酵全程杂菌污染的可显 著提高酒精产量和质量的酒精复合酶迫在眉睫。
【发明内容】
[0007] 本发明所解决的技术问题是克服现有酒精复合酶中蛋白酶活力低、复合酶酶系 不全、抗氧化能力低、酶活损失大、无抑菌作用或抑菌作用弱的缺陷，以高活力酸性蛋白酶 等食品级酶制剂为主要原料，科学复配植物提取物、抗氧化剂、啤酒花提取物、脱霉素、保护 剂、激活剂、耐酒精活性干酵母等，制备一种酶系全面、酶活力稳定、酶效力高的含酸性蛋白 酶的酒精复合酶，该复合酶可有效提高酒精产率和质量，适合各种原料制备酒精或燃料乙 醇。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种含酸性蛋白酶的酒精复合酶，由以下重量份数的原料组成：
[0010] 淀粉酶20 - 30份，蛋白酶15 - 25份，植物提取物10 - 15份，半纤维素酶10 - 12 份，啤酒花提取物10 - 12份，果胶酶8 - 10份，酯酶8 - 10份，耐高温酿酒干酵母7 - 10 份，脱霉素5 - 10份，植酸酶5 - 7份，保护剂4 一 6份，激活剂4 一 6份，抗氧化剂0. 6 - 1· 2 份；
[0011] 所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：70%糖化酶，10% 普鲁兰酶，10%真菌Ct 一淀粉酶，5% β -淀粉酶，5%中温a -淀粉酶；
[0012] 所述植物提取物中含有蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植 物酶；
[0013] 所述植物提取物中还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅 可为白酒酿造复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备酸性蛋白酶的发酵培养基成 分，提高蛋白酶活力和微生物产酶能力；
[0014] 所述植物提取物采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓 缩等低温提取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的 食品安全性；
[0015] 所述植物提取物的制备方法为：将大麦芽和小麦芽按质量比5 - 7 :3 - 5均匀混 合，粉碎至粒度0. 5 - 1mm，得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于超声波清洗机中 在功率200W、频率30KHz条件下超声清洗5 - lOmin，浙干，室温下破碎至粒度0. 5 - 1mm，并 按质量比5 - 7 :2 - 4 :1 一 3均匀混合，加入混合物质量1. 5 - 3倍的粉碎麦芽得原料混合 物，加入原料混合物质量1 一 3倍的水，用柠檬酸调节pH值为3 - 4,在功率150 - 300W、频 率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间60 - 80s，进行间隔式辐照：辐 照l〇s，间隔10s，控制温度20 - 35°C，如此辐照10次，同时在功率200 - 300W，频率30 - 40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1 一 3h，然后，在功率200 - 400W、频率2000Hz条 件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间90 - 105s，进行间隔式辐照：辐照15s，间隔 l〇s，控制温度40 - 60°C，如此辐照10次，同时在功率300 - 500W，频率40 - 50KHz条件 下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度25 - 35kV/cm，脉冲时间400 - 600 μ s，脉冲频率200 - 300Hz条件下进行高压脉冲电场（PEF)提取15 - 20min ;提取液 过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比 1 :1 一 2均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、低温粉碎即得植物提取物；
[0016] 优选地，所述超声波清洗机中清洗液为0. 3 - 0. 5%的碳酸氢钠溶液。
[0017] 所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：酸性蛋白酶80%， 中性蛋白酶10%，10%脯氨酸蛋白酶；
[0018] 优选地，所述酸性蛋白酶是以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉（Aspergillus usamil)CCTCC NO :M 2013601为出发菌株，经特定发酵条件下的液体深层发酵而制得，并且 发酵培养基中科学复配了上述制备的植物提取物；
[0019] 优选地，所述酸性蛋白酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的宇佐美曲霉CCTCC NO :M 2013601的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将种 子罐液体种子以5%接种量接入发酵罐培养基，培养温度31 - 321：，搅拌速度200-40(^/ m，通风量1:1-2,培养时间10-12h ;然后以1 一 2°C /h降温速率缓慢降温至26 - 30°C，搅 拌速度400-600r/m，通风量1:1-3,恒温培养8-10h ;继续以1 一 2°C /h降温速率缓慢降温 至23 - 251：，搅拌速度500-70(^/111，通风量1:2-4，培养时间22-3111，然后，将种子罐液体 种子以3%接种量追加接入发酵罐，最后以1 一 2°C /h升温速率缓慢升温至31 - 32°C，搅 拌速度200-400r/m，通风量1:1-2,恒温培养10-12h ;接着以1 一 2°C /h降温速率缓慢降温 至23 - 25°C，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,恒温培养22-31h ;发酵液经过滤、浓缩、 调配、精滤、干燥得固体酸性蛋白酶；
[0020] 所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物5 - 10g，干酪素4g， 磷酸氢二钾2g，氯化镁0. 6g，氯化钾0. 8g，蒸馏水1000mL，pH值5. 8,121°C灭菌20min。
[0021] 所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮60 - 80g，玉米粉50_60g，豆饼粉 35-40g，海藻糖10 - 15g，鱼粉6-10g，氯化铵10 -