一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业微生物及植物保护领域，公开了一种新的β-?，6-葡聚糖酶及其编 码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物病害是农作物高质优产的制约因素之一，据统计，全球因为植物病害导致的 作物产量损失约占16%，每年直接经济损失多达数亿美元。在植物病害中，70%_80%的病 害是由植物病原真菌侵染所引起的。植物真菌病害不仅直接造成作物产量下降和品质降 低，而且部分病原真菌在侵染农作物的过程中，还能分泌多种人畜有害的毒素和代谢产物， 对农产品的安全造成极大的威胁。
[0003] 植物真菌病害控制难度大，生产上急需有效的控制手段，随着高效、内吸、选择性 强的现代杀菌剂被开发和广泛应用，植物病害得到了一定的控制。但是也面临着植物对杀 菌剂抗性越来越严重和普遍的状况，导致植物病害病害化学防治失败，农业生产遭受巨大 损失。同时，杀菌剂在植物中积累，通过食物链的方式也会对动物造成危害。另外，植物抗病 品种选育虽然安全可靠，但是选育过程十分耗时，因此广谱抗真菌蛋白对抗病育种提高植 物抗病能力具有重要研究价值。
[0004] β-1，6-葡聚糖是真菌细胞壁中的特有结构，是专一性的抗真菌靶点。研究发现β-1，6_葡聚糖酶在生防木霉重寄生过程有一定的作用，但对其在抗真菌过程中的作用还未受 到重视。到目前为止关于β-1，6-葡聚糖酶的报道也仅有少数几例，来源于Trichoderma harzianum CECT 2413的一个酸性，6-葡聚糖酶BGN16 · 3 以及来源于Trichoderma harzianum的内切型β-1，6-葡聚糖酶等。β-1，6-葡聚糖是真菌细胞壁中重要的交联结构，将 长链的β-1，3-葡聚糖以及外层甘露聚糖交联形成网状结构，β-1，6-葡聚糖联结的破坏将破 坏整个细胞壁结构。
[0005] β-l，6-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)能够有效的裂解植物病原真菌细胞壁的重要组成 成分β-1，6-葡聚糖，从而破坏真菌细胞壁的结构，裂解菌丝，达到生物防治的效果。因此这 种抗菌蛋白因其诱发植物自身抗性、可行性强、无种属专一性、作用持久等特点，对抗病育 种具有重要价值。同时葡聚糖也是白色念珠菌以及造成灰指甲的病原真菌等人源致病菌 细胞壁含量最高的多糖，因此，β-l，6_葡聚糖酶同样能够破坏该类病原真菌的细胞壁结构， 从而为外涂抗真菌药物的开发提供实验材料。
[0006] 目前来源于微生物的β-1，6_葡聚糖酶主要来源于哈茨木霉以及放线菌，但由于其 活性较低以及相关性质的限制影响其应用。因此开发高活性广谱高效抗菌β-1，6_葡聚糖酶 具有重要的研究价值以及应用价值。根据报道AFP、i3_l，3葡聚糖酶和几丁质酶已经被成功 应用到作物抗病育种中，这也为β-1，6-葡聚糖酶在抗病性作物育种方面提供了方向。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种全新的β-l，6-葡聚糖酶及其编码基因，所述酶可以通过 氨基酸序列基序(一级结构）、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线BLAST比 对来识别。该β-l，6_葡聚糖酶为一种抗病原真菌的广谱抗病蛋白。
[0008] 本发明的另一目的是提供含有该β-1，6-葡聚糖酶基因的基因工程菌。
[0009] 本发明的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。
[0010]本发明所述β-1，6-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列为:SEQ ID Ν0.1，该基因全长(从 起始密码子到终止密码子)为3222bp，G+C含量为65.8 %，编码1073个氨基酸，理论分子量大 小为116.13KD，等电点为5.37。
[0011]本发明所述的β_1，6-葡聚糖酶基因编码的β-1，6-葡聚糖酶蛋白质，其氨基酸序列 为:SEQ ID ^).2。所述的0-1，6-葡聚糖酶最适反应?!1为7.〇，最适反应温度为5〇°(3，并在2〇 °C_50°C(lh)和pH 5.0-10.0(2处)之间保持活性稳定，该蛋白为典型的财斤叠桶状结构，具 有专一性水解β-l，6-葡聚糖的功能。
[0012]本发明所述的β-1，6-葡聚糖水解酶的活性分布区域为ATG起始端第79个碱基至第 1500个碱基，其核苷酸序列为:SEQ ID Ν0.4;氨基酸区域为Ν端第27个氨基酸至第500个氨 基酸，其氨基酸序列为:SEQ ID N0.5。
[0013]由本发明所述的SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5序列中一个或者多个氨基酸残基取 代、缺失或者添加所得到的多肽或蛋白，具有与本发明所述的GluM蛋白相同的β-1，6-葡聚 糖水解酶活性的，也在本发明保护范围内。
[0014] 本发明提供了 β-1，6-葡聚糖酶氨基酸序列在线BLAST序列比对，并构建了该蛋白 的进化树，得到来源于不同粘细菌属的与本发明的β-1，6-葡聚糖酶同源性高于50%的序 列，发现相关序列均被预测为通道蛋白（TonB Protein)，与β-l ,6-葡聚糖水解酶功能无关。 本发明随机挑选具有代表性的九个与本发明所述的β-1，6-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高 于50%，且来源于不同种类粘细菌的同源蛋白或者假设蛋白进行异源表达功能验证，发现 不同来源的同源蛋白均具有β-1，6-葡聚糖水解活性，这些蛋白也属于本发明保护范围。
[0015] 含有本发明所述的β-1，6-葡聚糖酶基因，所述的β-1，6-葡聚糖酶基因的变体，同 系物或片段，或所述的β-1，6-葡聚糖酶基因的活性分布区域的重组表达载体。
[0016] 本发明所述的β-1，6-葡聚糖酶基因、该基因的活性分布区域、含有该基因的重组 表达载体、含有该基因的宿主菌在构建抗真菌病害植物中的应用。
[0017]本发明提供了含有上述β-l，6-葡聚糖酶基因序列的载体，以及被该载体转化或转 导的宿主细胞或者被上述基因序列直接转化或转导的宿主细胞。
[0018] 本发明提供了一种抗植物病原真菌的转基因植株，转基因植株的构建过程包括两 个主要内容：
[0019] (1)提供携带表达载体的农杆菌；
[0020] (2)所述的表达载体含有SEQ ID NO. 1或者SEQ ID Ν0.4所述的β-1，6-葡聚糖酶的 DNA编码序列，或者携带与SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.5所述氨基酸序列的变体、或者活性 多肽片段、或活性多肽衍生物，且编码产物具备β-1，6-葡聚糖酶活性的基因序列；
[0021] 转基因植株的构建过程为:将植物细胞或组织或器官与步骤⑴农杆菌接触，从而 使β-1，6-葡聚糖酶基因编码序列转入植物细胞或者组织或者器官，并且整合到植物细胞的 染色体。通过对上述转染的植物细胞或者组织或者器官进行再生植株后，得到含有目的基 因的阳性转基因植株，对植株进行病原菌抗性鉴定，植株具有良好的抗性水平。本专利以拟 南芥和水稻作为转基因对象。
[0022] 本发明所述的β-1，6_葡聚糖酶GluM在植物病害的生物防治方面的应用。本发明所 述的β-l，6_葡聚糖酶GluM为一种广谱抗真菌蛋白，本专利以典型的气传病害-稻瘟病菌进 行生物防治实验，结果显示良好的抗性水平。
[0023] 本发明所述的β-l，6_葡聚糖酶GluM优选在防治和控制植物病原真菌对植物的损 害中的应用。
[0024] 其中，所述的植物病原真菌对植物的损害选自半知菌亚门真菌导致的病害:黄瓜 枯萎病，棉花枯萎病，棉花黄枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻纹枯病，卵菌门疫霉属 真菌导致的病害:大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌;鞭毛菌亚门单轴霉属真菌导致的病害:葡萄霜 霉病；子囊菌亚门单囊壳属真菌导致的病害:草莓白粉病;所述的植物选自小麦、玉米、大 豆、水稻、黄瓜、番茄、草莓、棉花或拟南芥。
[0025] 本发明提供了用于检测β-1，6_葡聚糖酶或者变体或者截短片段存在的抗体，检测 为阳性且具有β-1，6_葡聚糖水解酶活性的蛋白或者肽段即为本专利所述的β-1，6_葡聚糖 酶GluM或者变体或者截短片段。制备该抗体所用的肽段序列为SEQ ID Ν0.9或10或11。 [0026] 专利补充说明
[0027] 1.本专利描述了一种新的外膜型糖苷水解酶GluM，所述酶能够有效的水解酵母葡 聚糖，昆布多糖，石耳素等以β-1，6-糖苷键连接的多糖，尤其对短链β-1，6-糖苷键连接多糖 活性最好。
[0028] 2.本专利所述β-1，6-葡聚糖酶GluM"变体"是指这样的蛋白，由于氨基酸的插入、 缺失、突变、或取代而与本发明的参考氨基酸序列有差异。关于确定参考氨基酸序列中的哪 些氨基酸残基可以取代、添加或缺失的指引，可以通过比较特定参考多肽的序列与同源多 肽的序列，并使高度同源区（保守区）中被改变的氨基酸序列数目最小化，或通过用共有序 列代替这些氨基酸来找到。变体蛋白可以具有被取代的氨基酸，但同时仍保留参考蛋白的 功能活性。"变体