养的菌体培养液lmL于1.5mL的离心管中，1500r/min 4°C离心 5min，弃上清(注意尽量弃尽上清）；
[0136] (3)重复步骤(2)3~4次；
[0137] (4)在每一个离心管中加入100yL冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动离心管，使沉淀 悬浮，禁止剧烈震荡；
[0138] (5)1500r/min 4°C离心5min;
[0139] (6)在每一个离心管中加入100yL冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动离心管，使沉淀 悬浮，禁止剧烈震荡。
[0140] (7)感受态细胞制作完成，将其放在-70°c冰箱保存。
[0141] 2、连接产物pMD18-T_p53的构建
[0142] 将质粒pMD18-T与人抑癌基因 p53连接，得到连接产物pMD18-T-p53;
[0143] 所述连接的反应体系为:人抑癌基因 p53 8yL
[0144] 质粒 PMD18-T 2yL
[0145] solutionl 10yL
[0146] 共20yL体系，将上述溶液混匀，离心后，16°C连接过夜。
[0147] 3、连接产物pMD18-T_p53的转化
[0148] (1)从-70°C冰箱中取100yL感受态细胞悬液，将其放在冰盒中慢慢解冻；
[0149] (2)加入过夜连接好的连接产物pMD18-T-p53，轻轻混匀，冰浴上放置30min;
[0150] (3)42°C水浴中热激lmin，然后快速将管转移到冰浴中5min，该过程不要晃动离心 管；
[0151] (4)向管中加入500yLLB液体培养基，然后置于37°C条件下培养lh，使细菌复苏；
[0152] (5)将复苏菌液摇匀后4000r/min转离心lmin，收集沉淀，弃上清，留取菌液约50μ L；
[0153] (6)用枪轻轻吹打菌体至菌液浑浊；
[0154] (7)将菌液转移至Kana+/LB固体培养基(LB平板)上，将菌液均匀涂开；
[0155] (8)将LB平板置于37°C培养箱中，正面放置20~40min，至液体全部吸收；
[0156] (9) 37°C恒温培养箱中倒置过夜培养；
[0157] (丨〇)培养结束，LB平板于4°C保存。
[0158] 4、连接产物 pMD18-T_p53 的 PCR 检测
[0159] (1)用灭过菌的白色枪头挑取LB平板上的单个菌落于含有lmLLB液体培养基的 1.5mL的离心管中；
[0160] (2)将离心管放入37°C培养箱中，培养4~5h;
[0161] (3)以培养4~5h的菌液为模板做菌液PCR，检测单菌落是否为阳性菌落。
[0162] 连接产物pMD18-T_p53进行PCR检测，
[0163] 反应体系如下：
[0164]
[0165] 加灭菌去离子水补充至总体积20yL。反应条件为:①94°C预变性5min;②PCR扩增 共40个循环:94°C预变性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸1 Omin。
[0166] PCR结果见图3,图3结果表明，以单菌落菌液为模板进行PCR扩增p53基因，得到的 PCR扩增片段大小约为1183bp，与预期的片段大小相符。
[0167] 5、连接产物pMD18-T_p53的提取
[0168] (1)取PCR阳性菌落菌液，放入Kana+/LB液体培养基中，在37°C培养箱中过夜培养；
[0169] (2)将过夜培养的菌液转移1.5mL离心管中，8000r/min离心2min，弃上清;重复2-3 次上述步骤，倒尽或着吸干培养基，收集菌体；
[0170] (3)在菌体沉淀中加入250yLBuffer P1，吸打或者震荡至彻底悬浮菌体；
[0171] (4)加入250yLBuffer P2,立即温和颠倒离心管5~10次，室温下静置2-4min;
[0172] (5)加入350yLBuffer P3,立即温和颠倒离心管5~10次充分混匀；
[0173] (6)于离心机最大转速（2 12000r/min)离心5~lOmin，将上清全部小心转移至吸 附柱，9000r/min离心30s;倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
[0174] (7)在吸附柱中加入500yL的去蛋白液Buffer DW1，9000r/min离心30s ;倒掉收集 管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
[0175] (8)向吸附柱中加入500yLWash Solution，9000r/min离心30s，倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中；
[0176] (9)重复上述步骤(8)-次；
[0177] (10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000r/min离心lmin;
[0178] (11)在吸附膜中加入50yLElution buffer室温下静置1~2min，9000r/min离心 lmin，所得溶液即为连接产物pMD18-T-p53的DNA。
[0179] 6、连接产物pMD18-T_p53的酶切鉴定
[0180] 取3-5yL提取的连接产物pMD18-T-p53,进行Hindm和BamHI限制性内切酶消化鉴 定。
[0181] 酶切消化体系为：
[0182] 总体积20yL，30°C消化4h，进行质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果 (结果见图4)。图4结果表明，连接产物pMD18-T-p53酶切产物的片段大小分别约为2692bp和 1183bp，与预期片段大小相符。
[0183] 7、连接产物pMD18-T_p53的酶切鉴定
[0184] 将菌液PCR为阳性，酶切消化鉴定正确的连接产物pMD18-T_p53送上海生工生物工 程有限公司测序（结果见图5)。测序完成后运用GenBank中进行碱基序列比对及同源性分 析，测序结果与Genebank上的公布的序列（登录号:NW_926584.1)进行了同源性比对，结果： 序列的同源性为98%，证明成功构建了重组质粒pMD18-T-p53。
[0185] 实施例3鸡MAR基因的克隆
[0186] 1、鸡MAR基因的克隆引物的设计与合成
[0187] 参照GenBank鸡MAR序列的全序列（登录号:M58748 · 1GI: 211883)，设计要扩增的上 下游引物，由江苏金唯智工程技术服务有限公司合成。
[0188] 上游引物序列（Primer c):5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'（SEQ ID N0.4)
[0189] 下游引物序列（Primer d):5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3'（SEQ ID N0.5)
[0190] 2、鸡肝脏组织中MAR基因的提取
[0191] 鸡肝脏组织中MAR序列的提取采用上海生动物基因组DNA提取试剂盒，具体步骤如 下：
[0192] (1)取50mg鸡肝脏组织放入匀浆器中，加入100yL的Buffer Digestion，用力快速 将其研磨碎，把研磨好的组织液转入1.5ml的离心管中，接着向匀浆器中连续两次加入200μ L的Buffer Digestion进行冲洗，接着将离心管放入65°C恒温水浴锅中lh直至细胞完全裂 解；
[0193] (2)加入200yLBuffer PA，充分颠倒混匀，至于-20°C冰箱内放置5min;
[0194] (3)室温下lOOOOrpm离心5min，将上清液500yL转移到新的离心管中；
[0195] (4)加入等体积的氯仿混匀，12000rpm离心取上清；
[0196] (5)加入等体积的异丙醇，颠倒5~8次使之充分混匀，室温下放置2~3min;室温下 lOOOOrpm离心5min，弃上清；
[0197] (6)加入lmL质量分数75%乙醇，颠倒漂洗l-3min，10000rpm离心2min，弃上清；
[0198] (7)重复步骤6;
[0199] (8)开盖室温倒置5~10min至残留的乙醇完全挥发；
[0200] (9)得到的DNA用lOOyLTE Buffer溶解，提取的DNA可立即进行下一步实验或-20°C 保存。
[0201 ] 3、鸡核机制结合区序列MAR基因的克隆
[0202] 鸡MAR基因经过PCR扩增得到，具体步骤如下：
[0205] 再加入灭菌去离子水至20yL。
[0206] PCR反应条件为:①预变性:94°C、4min;②PCR扩增共40个循环，前5个循环:94°C预 变性30s、54°C退火40s、72°C延伸90s;中间五个：94°C预变性30s、56°C退火40s、72°C延伸 90s;最后30个循环：94°C预变性30s、60°C退火40s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin，反 应结束。
[0207] 将PCR扩增产物进行质量分数1 %琼脂糖凝胶电泳(结果见图6)，然后用上海生工 生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收试剂盒纯化回收，并置于-20°C保存备用。图6结 果表明，PCR扩增产物的片段大小约为1044bp，与预期目的片段大小相符。
[0208] 实施例4重组质粒pEGEP-Nl_p53的构建
[0209] 重组质粒pEGEP-Nl_p53的构建流程示意图参见图7。
[0210] 1、重组质粒PMD18-T_p53和载体pEGFP-Nl的提取、酶切及纯化回收
[0211] 重组质粒pMD18-T-p53和载体pEGFP-Nl的提取，参照上海生工生物工程有限公司 的SanPr印柱式质粒DNA小量抽提试剂盒。其中载体pEGFP-Nl的图谱见图8。
[0212] 将重组质粒pMD18-T_p53和载体pEGFP-Nl同时进行双酶切，参照Takara公司内切 酶的使用说明书。
[0213] 酶切的消化体系为：
[0214] 酶切体系总体积均为80yL，30°C酶切4h;酶切产物质量分数1.0 %的琼脂糖凝胶电 泳鉴定酶切产物并纯化回收。
[0215] 质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在凝胶成像系统中观察电泳条带，电泳 条带与目的片段的大小基本一致，对目的条带P53和载体pEGFP-Nl酶切产物进行纯化回收。 具体操作步骤严格参照上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收试剂盒说明书 操作。
[0216] 2、连接产物pEGEP-Nl_p53的构建
[0217] 将纯化回收的人抑癌基因 p53和载体pEGFP-Nl酶切产物进行连接。
[0219] 补加灭菌去离子水至总体积为20yL，将上述溶液混匀，20°C连接5h。
[0220] 3、连接产物pEGEP-Nl_p53的转化
[0221] 连接产物pEGEP-Nl-p53的转化方法参照实施例2中的连接产物pMD18-T-p53的转 化方法。
[0222] 4、连接产物pEGEP-Nl_p53的鉴定
[0223] (1)用灭过菌的白色枪头挑取LB平板上的单个菌落于含有lmLLB液体培养基的 1.5mL的离心管中；
[0224] (2)将离心管放入37°C培养箱中，培养4~5h;
[0225] (3)以培养4~5h的菌液为模板做菌液PCR，检测单菌落是否为阳性菌落(结果见图 9)〇
[0226] 连接产物pEGEP-Nl_p53进行PCR检测，
[0228]加灭菌去离子水补充至总体积20yL。反应条件为:①94°C预变性5min;②PCR扩增 共40个循环:94°C预变性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸1 Omin。
[0229]图9结果表明，PCR扩增产物片段大小约为1183bp，与预期目的片段大小相符。
[0230] 5、连接产物pEGEP-Nl_p53的提取
[0231] 连接产物pEGEP-Nl-p53的提取方法参照实施例2中的连接产物pMD18-T-p53的提 取方法。
[0232] 6、连接产物pEGEP-Nl_p53的酶切鉴定
[0233] 将所提取的连接产物pEGEP-Nl_p53进行Hindm限制性内切酶消化鉴定。参照大连 宝生物公司内切酶使用说明书。
[0236]总体积30yL，30°C消化4h，进行质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果 (结果见图10)。质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在凝胶成像系统中观察电泳条 带，电泳条带与目的片段的大小基本一致，则构建重组质粒PMD18-T-P53成功。
[0237] 实施例5表达载体pEGFP-Nl_p53/MAR的构建
[0238] 1、重组质粒pEGEP-Nl_p53的提取