基于双链微载体将car基因定点整合至t细胞aavs1位点的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因治疗领域。更具体地说，本发明涉及一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVSl位点的方法。
【背景技术】
[0002]嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)T细胞疗法属于癌症免疫疗法的范畴，其主要策略是通过基因工程在T细胞上表达一种人工改造过的受体，该受体包含了可识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体单链可变区域(single-chain variable fragments ,scFV)和胞内信号域(参见Porter D L,Levine B L1Kalos M,et al.Chimeric antigenreceptor-modified T cells in chroniclymphoid leukemia[J].New England Journalof Medicine,2011,365(8):725-733.和Krug C1Wiesinger M1Abken H，et al.A GMP-compliant protocol to expand and transfect cancer patient T cells with mRNAencoding a tumor-specific chimeric antigen receptor[J].Cancer Immunology,Immunotherapy，2014:1-10和Sadelain MjBrentjens R, Riviere 1.The basicprinciples of chimeric antigen receptor design[J].Cancer discovery，2013，3(4):388-398.)。携带CAR的T细胞可直接识别目的抗原，而不在乎抗原是否递呈在MHC上，从而避免了 “MHC限制性”。在体内受到目的抗原刺激时可诱发一系列细胞免疫反应，最终杀灭靶细胞。理论上，通过改变受体的识别特异性，CAR-T细胞能够靶向任意一种肿瘤细胞，具有广阔的应用前景(Grada Z,Hegde MjByrd T，et al.TanCAR:a novel bispecific chimericantigen receptor for cancer immunotherapy[J].Molecular Therapy—NucleicAcids，2013，2(7):el05.和Bejcek B E,Wang D,Berven E，et al.Development andcharacterizat1n of three recombinant single chain antibody fragments(scFvs)directed against the CD19antigen[J].Cancer research，1995，55(II):2346-2351.和Eshhar Z,Waks T,Gross G，et al.Specific activat1n and targeting of cytotoxiclymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-bindingdomains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T—cellreceptors[J].Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences，1993，90(2):720-724.)。
[0003]目前较为成熟的治疗策略包括，体外分离病人的T细胞，用慢病毒或逆转录病毒作为载体将编码CAR的基因整合到T细胞中，筛选稳定转染的细胞扩增后回输到病人体内。但慢病毒和逆转录病毒载体的基因整合形式为随机插入，在临床应用中存在免疫反应和基因突变的风险(Lipowska-Bhal la GjGi Iham D E , Hawkins R E，et al.Targetedimmunotherapy of cancer withCAR Tcells!achievements and challenges[J].CancerImmunology，Immunotherapy，2012，61(7):953-962.和June C HjBlazar B RjRiley JL.Engineering lymphocyte subsets: tools , trials and tribulat1ns[J].NatureReviews Immunology,2009,9(10):704-716.和Bendle G M,Haanen JBA G,SchumacherT N M.Preclinical development of T cell receptorgene therapy[J].Currentopin1n in immunology，2009,21(2): 209-214.)。为了克服这一风险，我们需要将 CAR 基因特异性的整合到基因组中的已知安全区域，这样才能保证外源基因的长期安全表达。
[0004]AAV-1TR微载体是一种基于腺相关病毒基因组的线性闭环双链载体，它的结构简单，5’端和3’端分别为AAV2的倒置末端重复序列(ITR)，包围着中间的外源基因开放阅读框，研究者将其称为“CELiD” (closed-ended, linear duplex DNA)。不同于传统的细菌质粒载体，微载体删除了质粒复制序列，抗性基因等绝大部分细菌DNA，只保留基因表达所必需的顺式作用元件(参见Li L1Dimitriadis E K , Yang Y , et al.Product1n andCharacterizat1n of Novel Recombinant Adeno-Associated Virus Replicative-FormGenomes: A Eukaryotic Source of DNA for Gene Transfer[J].PloS one ,2013,8(8):e69879.)。其次，微载体是在真核细胞Sf9中生产，避免了内毒素污染的问题。AAV-1TR微载体的优点包括:低免疫源性;分子量小，易于转染;能够抵抗核酸外切酶的降解，基因表达持久稳定。重要的是，在AAV-Rep蛋白帮助下能够定点整合到19号染色体AAVSl位点(参见Zhang C,Cortez N G,Berns K 1.Characterizat1n of a bipartite recombinantadeno-associatedviral vector for site-specific integrat1n[J].Human genetherapy，2007，18(9): 787-797.) ^AVSl位点已被证明是安全可靠的位点，整合到这一位点的基因能够长期稳定的表达，而且至今没有发现致病性。
[0005]若能利用CELiD载体携带CAR基因，同时构建一个质粒pCMV-Rep来提供整合所需的Rep78和Rep68蛋白，将这两个载体共转染T细胞，从而实现CAR基因在T细胞内的定点整合，则相关技术将极大的增强CAR-T疗法的安全性。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0007]本发明还有一个目的是提供一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVSI位点的方法，定点整合的CAR基因能够长期稳定表达并且行使正常的免疫激活功能，可极大的提高CAR-T细胞的安全性。
[0008]为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于双链微载体将CAR基因定点整合至T细胞AAVSI位点的方法，其包括以下步骤:
[0009]I)针对某一特异性肿瘤抗原，利用基因文库、PCR技术、化学合成等方法，遵循CAR基因设计原则，设计合成CAR基因；
[0010]2)将步骤I)合成得到的所述CAR基因插入杆状病毒包装质粒PFastBacDual-1TR-NeoR中，构建得到质粒pFastBacDual-1TR-CAR-NeoR，其中NeoR为新霉素抗性基因，后续步骤中将携带此基因的质粒转染细胞系后，可通过G418进行对转染成功的细胞进行筛选；
[0011]3)将步骤2)得到的质粒pFastBacDual-1TR-CAR-NeoR利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统，在昆虫细胞Sf9中制备携带有CAR和NeoR的双链微载体CELiD?载体；
[0012]4)使用所述CELiDeAR载体和pCMV-Rep质粒共同电转染体外培养的人T细胞，将CAR基因定点整合到所述T细胞的19号染色体AAVSl位点；
[0013]5)利用G418培养基体外药物筛选和扩增步骤4)中成功稳定转染CAR基因的T细胞，并对所述成功转染CAR基因的T细胞进行基因整合位点的鉴定、CAR受体表达鉴定以及CAR受体免疫激活功能鉴定；
[0014]其中，所述pCMV-Rep质粒的构建步骤为:使用PCR扩增AAV-Rep，经XbaI和BgI Π消化后连入质粒PCMV-MCS，得到pCMV-R印。
[0015]优选的是，其中，步骤2)所述pFastBacDual-1TR-NeoR构建的步骤为使用PCR扩增基因NeoR，再经BamHI和Xhο I消化后连入质粒pFastBacDual -1TR-MCS中，构建得到PFastBacDual-1TR-NeoRo
[0016]优选的是，其中，步骤2)所述CAR基因插入pFastBacDual-1TR-NeoR中的步骤为使用PCR 扩增 IRES，再经 BamHI 消化后连入所述 pFastBacDua 1-1 TR-NeoR JiI^lJpFastBacDual-1TR-1RES-NeoR，步骤I)合成得到的CAR基因经EcoRl消化后连入所述pFastBacDual-1TR-1RES-NeoR，得到pFastBacDual-1TR-CAR-NeoR，其中 IRES为核糖体募集序列，可用一条mRNA同时编码出CAR和NeoR两个蛋白。
[0017]优选的是，其中，步骤3)在昆虫细胞Sf9中制备携带有CAR和NeoR的双链微载体CELiD?载体的步骤为:
[0018]首先将步骤2)得到的质粒pFastBacDual-1TR-CAR-NeoR转化DHlOBac感受态，得到杆状病毒质粒Bacmid-1TR-CAR-NeoR，然后转染昆虫细胞Sf9，收集并扩增杆状病毒Bac-CAR，收集P3代病毒，在杆状病毒Bac-Rep的辅助下共感染Sf9细胞，得到双链闭环微载体CELiDcar，其中杆状病毒Bac-R印可表达R印蛋白，Rep蛋白可帮助ITR在Sf 9细胞中大量复制。
[0019]优选的是，其中，步骤4)所述CELiD?载体和pCMV-Rep质粒的比例为2?10。
[0020]优选的是，其中，步骤4)电转染的条件为:电压为750?800V、脉冲时间为20?30ms、T细胞的密度为I X 18?2 X 108/ml，以保证最佳的电转染效果。
[0021]本发明至少包括以下有益效果:
[0022]本发明可实现CAR基因在T细胞内的定点整合于19号染色体AAVSl位点的人T细胞，改造过的人T细胞能够表达CAR受体，在体外激活试验中能够识别其特异性的抗原并激活T细胞，从而本发明能够极大的提高CAR-T细胞的安全性，具有潜在的临床应用价值。
[0023]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0024]图1为本发明的一个实施例中CD19特异性CAR受体的结构示意图；
[0025]图2为本发明的另一个实施例中质粒pFastBacDual-1TR-CAR-NeoR的结构示意图；
[0026]图3(a)为本发明的另一个实施例中质粒pCMV-Rep的结构示意图；
[0027]图3(b)为图3(a)中Rep蛋白的剪接图；
[0028]图3(c)为图3(a)中Rep蛋白的WesternBlot图谱；
[0029]图4(a)为本发明的另一个实施例中单体和二聚体微载体Smal酶切预期条带；
[0030]图4(b)为本发明的另一个实施例中微载体CELiD?的电泳图；
[0031 ]图4(c)为本发明的另一个实施例中微载体CELiD?经Smal酶切的电泳图；
[0032]图5(a)为本发明的另一个实施例中T细胞在G418抗性筛选培养基上的生长情况；
[0033]图5(b)为未经改造T细胞在G418抗性筛选培养基上的生长对照情况；
[0034]图6(a)为对本发明CAR-T细胞采用巢氏PCR鉴定整合位点时巢氏PCR引物的设计示意图；
[0035]图6(b)为本发明CAR-T细胞经巢氏PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图；
[0036]图7为本发明经改造T细胞表面CAR受体表达的流式分析图；
[0037]图8为本发明CAR功能鉴定中T细胞细胞因子IFN-γ的Elisa检测图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令