酶解豆粕制备ace抑制肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品技术领域，尤其是涉及一种酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法。
【背景技术】
[0002]ACE抑制肽，即血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP ,Ang1tensin ConvertingEnzyme Inhibitory Peptides)，是一些具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同，但都具有类似的功能，即有降血压的功能，所以又称为降血压肽。1981年第一个合成口服有效的肽类ACE抑制剂一一巯甲丙脯酸(captopril)问世，迄今已有许多化学合成的ACE抑制剂应用于临床。然而这类药物作用时间不长，停药后会使血压反弹;经肾脏排出易损害肾功能，有一定的副作用。国内外研究表明，食源性蛋白质酶解产物中的一些短肽具有广泛的生理调节功能，特别是具有降血压活性的ACE抑制肽受到广泛的关注，这些降血压肽只对高血压患者起降压作用，对血压正常者无降压作用，这些肽又是利用酶解技术从蛋白质中提取得到的，安全性很高。
[0003]高温豆柏是由大豆浸油后，经高温脱溶所得。豆柏中约含45%-50%的蛋白质，以及10%-15%的低聚糖、20%-25%的多糖和纤维素，有很高的开发和利用价值。我国是世界产粮和产油大国，每年粮油加工中产生大量豆柏副产品，豆柏资源丰富。目前高温豆柏主要用作饲料，在食品上的应用极少，只限于酿造食品。酶水解豆柏是利用现代生物技术将大豆蛋白通过蛋白酶酶解为可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。来源于大豆蛋白的ACE抑制肽的降压效果虽然不及化学合成的降血压药，但其无毒副作用，安全性高，且对血压正常者无降压作用，特别适用于作为口服药剂或功能性食品基料，添加制成各种保健食品，用来预防、缓解和辅助治疗高血压。
[0004]目前，ACE抑制肽没有投入大规模的生产应用，其主要原因是:缺乏价廉有效、便于生产的酶制剂，不能有效实现酶解产物分子量的控制，严重影响后期纯化效果;无法有效解决酶解产物苦味问题，限制其在食品领域的应用。
[0005]为了提高豆柏资源的利用率，提高大豆肽的水解度，降低ACE抑制肽的生产成本，生产稳定性好、适用性广的ACE抑制肽粉末状产品，本发明以大豆柏为原料，选取价格低廉、作用效果明显、条件容易控制的酶制剂，优化酶解条件，探索有效地提纯方法，提高ACE抑制肽提取效率，以期解决目前酶解法工业化制备ACE抑制肽急需解决的问题，开拓ACE抑制肽的工业化生产之路。本发明一方面增加了豆柏的附加值，创造良好的经济效益和市场价值；另一方面，将豆柏ACE抑制肽的降压功能得到最大化利用，具有良好的应用价值和社会效益。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明旨在提出一种酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法，提升了现有豆柏资源的利用价值，加工制备出食源性具有ACE抑制活性的豆柏蛋白肽。
[0007]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的:
[0008]一种酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法，包括如下步骤:
[0009](I)豆柏预处理
[0010]将高温豆柏进行粉碎、过筛，所得豆柏粉与水以质量比为1:(4-6)的配比进行混合，搅拌均匀，调节PH值为8-10，进行超声，得到豆柏混合物；
[0011]⑵酶解
[0012]调节豆柏混合物的pH值为7-9，加入豆柏混合物质量的3%_5 %的复合酶制剂，混合均匀，在35-50°C温度下，水解时间5-8小时，然后将水解液沸水浴煮沸灭酶，冷却至室温，得到混合液;其中，复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的原料制成;其中，碱性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为(5-7):(3-5):(1-3):(2-4): (2-4): (1_3);
[0013](3)分离
[0014]调节混合液的pH值为6.5-7.5，进行离心，取上清液，将上清液进行超滤处理，得到滤过液；
[0015](4)将滤过液真空冷冻干燥，得到ACE抑制肽粉末。
[0016]进一步，:所述的步骤(I)中过筛步骤的筛子选择60目筛。
[0017]进一步，所述的步骤(I)中超声步骤的条件为:功率150-400W，温度40_50°C，时间10_20mino
[0018]进一步，所述的步骤(I)中粉碎步骤使用粉碎机。
[0019]进一步，所述的步骤(2)中沸水浴步骤的时间为10-20min。
[0020]进一步，所述的步骤(3)中离心步骤使用高速冷冻离心机。
[0021 ] 进一步，所述的步骤(3)中离心步骤的条件为:转速4000-4500r/min，时间10-20mino
[0022]进一步，所述的步骤(3 )中超滤步骤将上清液分别通过101(0&、61(0&、31(0&的超滤膜进行超滤处理。
[0023]进一步，所述的步骤(3)中碱性蛋白酶的酶活为11000U/g，胰蛋白酶的酶活为ιοοοου/g，枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g，中性蛋白酶为50000U/g，木瓜蛋白酶的酶活为2000000U/g，菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g。
[0024]相对于现有技术，本发明所述的酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法具有以下优势:
[0025]本发明所述的酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法采用的原料新，资源丰富，可以充分开发高温豆柏的利用价值;本发明的工艺简单易行，整个过程反应条件温和，使用复配好的复合酶制剂，便于工业化加工操作，可制备成胶囊类制品，方便保存和食用;本发明的应用范围广泛，制备的食源性ACE抑制肽产品，ACE抑制率可达到35 %?44 %，食用安全性高，可作为药品、功能性食品、食品、食品添加剂等进一步加工利用。
【具体实施方式】
[0026]除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。
[0027]所有的数字标识，例如PH、温度、时间、浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
[0028]本发明中涉及到的ACE抑制率测定方法如下:
[0029]取40yL待测液于试管中，与含5mM马尿酰-组氨酰-亮氨酰(HHL)作底物的0.1M硼酸缓冲液(含0.3MNaCl，pH值为8.3)相混合，再与20yL酶液(0.lU/mL)混合。将混合液在37°C反应60min，加入150yL IN盐酸终止反应。再加入1.0mL乙酸乙酯，振荡20秒，3000r/min离心10111；[11，分离上层0.81]11^乙酸乙酯层。将该层在120°(3加热40111；[11以挥去溶剂，加31]11^蒸馈水，振荡约20s。提取出的马尿酸在228nm处测其吸收值。
[0030]ACE抑制率以下列公式计算:
[0031 ] ACE抑制率=((A-B)/(A-C)) X 100%
[0032]A:228nm空白对照品吸收值
[0033]B:228nm待测样品吸收值
[0034]C:228nm既无酶又无样品吸收值
[0035]下面结合实施例来详细说明本发明。
[0036]实施例1
[0037]—种酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法，包括如下步骤:
[0038](I)豆柏预处理
[0039]将高温豆柏使用粉碎机进行粉碎、过60目筛，所得豆柏粉与水以1:5的质量比混合，搅拌均匀，调节pH值为9，进行超声，超声功率300W，温度40°C，时间15min得到豆柏混合物；
[0040](2)酶解
[0041 ]调节豆柏混合物的pH值为7.2，加入豆柏混合物质量的4%的复合酶制剂，混合均匀，在40°C温度下，水解时间6小时，然后将水解液沸水浴煮沸灭酶lOmin，冷却至室温，得到混合液;其中，复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的原料制成;碱性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为6:4:1:3:2:1;碱性蛋白酶的酶活为11000U/g，胰蛋白酶的酶活为10000U/g，枯草杆菌蛋白酶的酶活为100000U/g，中性蛋白酶为50000U/g，木瓜蛋白酶的酶活为2000000U/g，菠萝蛋白酶的酶活为1000000U/g;
[0042](3)分离
[0043]调节混合液的pH值为7，使用高速冷冻离心机进行离心，离心转速4000r/min，时间1min，取上清液，将上清液先后通过1KDa、6KDa、3KDa的超滤膜进行超滤处理，得到滤过液；
[0044](4)将滤过液真空冷冻干燥，得到ACE抑制肽粉末。
[0045]将所述的ACE抑制肽粉末进行ACE抑制率的测定，测定得到ACE抑制肽粉末的抑制率为39%。
[0046]实施例2
[0047]一种酶解豆柏制备ACE抑制肽的方法，包括如下步骤:
[0048](I)豆柏预处理
[0049]将高温豆柏使用粉碎机进行粉碎、过60目筛，所得豆柏粉与水以1:4的质量比混合，搅拌均匀，调节PH值为8，进行超声，超声功率400W，温度40°C，时间1min得到豆柏混合物；
[0050](2)酶解
[0051]调节豆柏混合物的pH值为8，加入豆柏混合物质量的5%的复合酶制剂，混合均匀，在50°C温度下，水解时间5小时，然后将水解液沸水浴煮沸灭酶lOmin，冷却至室温，得到混合液;其中，复合酶制剂包括由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、