一种茎环结构组合探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种具有茎环结构的组合探针，以及该 组合探针在端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 端粒酶(Telomerase)是一种使端粒延伸的反转录DNA合成酶，是由RNA和蛋白质组 成的核糖核酸-蛋白质复合物。端粒酶弥补了因每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度。但是 端粒酶的活性在正常体细胞中受到相当严密的调控，所以端粒酶活性在正常的人体细胞中 受到抑制，但在肿瘤细胞中被激活，与癌细胞的不断增殖密切相关。所以检测端粒酶的活 性，可以实现对癌症的诊断，同时以端粒酶为靶标分子，研究有效的端粒酶活性抑制剂，对 开发抗癌药物具有重要意义。传统的检测端粒酶的方法主要是基于PCR扩增技术的端粒重 复放大的方法（Telomeric Repeat Amplification protocol，TRAP)。该方法在经过 PCR 扩 增后进行电泳分离和检测，可以检测到几个癌细胞中端粒酶的活性，但是操作比较繁琐，而 且电泳分析不能达到定量分析的结果。更为重要的是在筛选端粒酶活性抑制剂实验过程 中，这些抑制剂也可能抑制PCR扩增反应中DNA聚合酶的活性，所以TRAP方法不适于端粒酶 抑制剂的筛选检测。随后发展起来的端粒酶检测方法是放射性同位素标记后的成像分析， 该方法存在放射性污染，对人体和环境有一定的危害，由此大大增加了操作的复杂性，限制 了该方法的应用。所以人们一直在努力研究建立端粒酶活性检测方法。如表面等离子体共 振、电化学分析、量子点荧光共振能量转移、端粒酶诱导生成金属纳米线、具有催化性能的 分子信标、PPI生物发光等。但是这些方法由于缺乏有效的DNA扩增信号放大过程，导致这些 方法的灵敏度都达不到TRAP的水平。因此，考虑到抗癌药物筛选工作量大以及检测成本等 各方面的需要，理想的端粒酶活性检测方法应摆脱放射性污染的缺点，且需满足检测快速、 操作简便、选择性好、灵敏度高、可靠、普适、经济等特点。
[0003] RNA和DNA是生命体重要的遗传物质，RNA和DNA的表达水平与癌症发展密切相关， 可以作为癌症早期诊断的标志物，对特定序列RNA和DNA进行准确、灵敏检测对于RNA和DNA 生物功能的研究和癌症早期诊断都具有十分重要的意义。RNA和DNA的分析方法主要为杂交 反应的检测方法。其中Southern印迹杂交方法需要经过电泳分离，结合放射性同位素标记 或酶标记利用放射自显影或酶反应显色实现RNA和DNA的定量分析。该方法存在放射性危 害，对人体造成伤害，且检测信号无法实时监测等弊端，需要复杂的操作步骤才能实现信号 的读出。分子信标(Molecular Beacon，简称MB)探针技术以发夹结构存在，其茎部双链两端 分别标记荧光基团和猝灭基团，无目标RNA或DNA存在时，MB以发夹结构存在，荧光猝灭。目 标RNA或DNA存在时会与MB杂交产生目标RNA或DNA的特异性荧光信号，该分子信标检测方法 已经获得了广泛应用。但需要指出的是该方法缺乏信号放大机制，使得检测灵敏度受到了 很大的限制，并且分子信标需要双标记，价格昂贵。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测存 在的问题，提供一种成本低廉、灵敏度高、选择性好的茎环结构组合探针，以及该组合探针 在端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测中的应用。
[0005] 解决上述技术问题所采用的技术方案是:该组合探针由两个具有茎环结构的DNA 序列组成，其中探针I和探针II从5'端到3'端依次为茎环区、检测物识别区，所述的检测物 为端粒酶、RNA或DNA，探针I和探针II的茎环区的碱基序列相同或不同，其中当检测物为端 粒酶时，所述探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列，探针II的检测物识别区是与端粒酶 延伸序列中8~40个碱基互补的序列；当检测物为RNA或DNA时，所述探针I的检测物识别区 是与待测RNA或DNA的邻近3'端8~40个碱基互补的序列，探针II的检测物识别区是与待测 RNA或DNA的邻近5'端8~40个碱基相同的序列。
[0006 ]上述的茎环区的茎的长度优选为5~18个配对的碱基序列，茎环区的环的长度优 选为15~35个碱基序列。
[0007] 上述的检测物为端粒酶时，探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列，优选探针II 的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中15~25个碱基互补的序列。
[0008] 上述的检测物为RNA或DNA时，优选探针I的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻 近3'端15~25个碱基互补的序列，优选探针II的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近5' 端15~25个碱基相同的序列。
[0009] 本发明茎环结构组合探针在检测端粒酶活性中的应用，具体检测方法为:将检测 物识别区为端粒酶底物序列的探针I加入待测端粒酶中进行反转录反应，反应完后加入检 测物识别区是与端粒酶延伸序列中8~40个碱基互补的序列的探针II，在Bst DNA聚合酶的 作用下进行环介导的等温核酸扩增反应，并加入SYBR Green I荧光染料，实时检测荧光信 号，根据实时荧光曲线的最大拐点所对应的时间即可确定端粒酶的活性高低，时间越长说 明端粒酶活性越低，时间越短说明端粒酶活性越高。
[0010] 本发明茎环结构组合探针在定量检测RNA或DNA中的应用，具体检测方法为:将检 测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3'端8~40个碱基互补的序列的探针I加入不同浓度 的待测RNA或DNA标准样品中，并加入顶替引物A，在BstDNA聚合酶的作用下进行延伸顶替反 应，反应结束后加入检测物识别区是与RNA或DNA的邻近5'端8~40个碱基相同的序列的探 针II和顶替引物B，进行延伸顶替反应和环介导的等温核酸扩增反应，并加入SYBR Green I 荧光染料，实时检测荧光信号，绘制浓度与实时荧光强度的最大拐点对应时间的标准曲线； 按照上述方法测试待测RNA或DNA样品的实时荧光强度最大拐点对应的时间，结合标准曲线 即可确定待测样品中RNA或DNA的含量。
[0011] 上述的顶替引物A是与待测RNA或DNA中5~30个碱基互补的序列，且该5~30个碱 基与待测RNA或DNA中与探针I检测识别区互补部分的3'端邻近;所述的顶替引物B是与待测 RNA或DNA中5~30个碱基相同的序列，且该5~30个碱基与待测RNA或DNA中与探针II检测识 别区相同部分的5'端邻近。
[0012] 本发明茎环结构组合探针在端粒酶抑制剂筛选中的应用，具体方法与端粒酶活性 检测方法相同，只需在制备端粒酶延伸产物时加入端粒酶抑制剂。
[0013] 本发明的有益效果如下：
[0014] 1、本发明组合探针不需要荧光标记和放射性元素标记，该探针特有的颈环结构为 下一步核酸扩增反应提供了特异性的扩增模板，克服了传统放射性标记存在的放射性危害 和大多数核酸扩增反应中非特异性扩增的发生。
[0015] 2、本发明组合探针用于端粒酶活性分析操作极为简便，只需将癌细胞经过裂解就 可以得到含有端粒酶的细胞裂解液，直接用于端粒酶底物的反转录延伸反应，不需要复杂 的分离提纯过程，大大提高了该方法操作的简便性，在普通的生物实验室即可完成，克服了 现有端粒酶活性检测方法步骤繁琐、成本较高、灵敏度低和选择性低等缺点，可以有效地检 测到单个癌细胞中端粒酶的活性，应用前景广阔。
[0016] 3、本发明组合探针可通过实时荧光分析法进行端粒酶活性检测，而荧光分析方法 非常适用于与一些自动化仪器相结合进行高通量检测，因此在高通量端粒酶抑制剂的筛选 中也展现出了巨大的应用潜力。
[0017] 4、本发明组合探针对癌细胞中RNA和DNA也可以进行良好的定量检测，克服了升降 温过程耗时的缺点，实现了恒温条件下的信号快速放大，具有高的灵敏度和扩增效率。
[0018] 5、本发明组合探针还可通过终点荧光检测、共振光散射检测、凝胶电泳检测等分 析方法进行端粒酶活性及RNA和DNA的定量检测。
【附图说明】
[0019] 图1是实施例1中茎环结构组合探针检测端粒酶的原理示意图。
[0020] 图2是荧光强度随着端粒酶浓度变化的实时荧光曲线图。
[0021 ]图3是不同浓度抑制剂对端粒酶活性抑制的实时荧光曲线图。
[0022] 图4是实施例2中茎环结构组合探针检测mRNA的原理示意图。
[0023] 图5是荧光强度随着mRNA浓度变化的实时荧光曲线图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0025] 实施例1
[0026] 针对端粒酶底物序列5' -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'，设计合成具有茎环结构的探针 I 和探针 I I ， 探针 I 的碱基序列为 5 '- CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '(由宝生物工程（大连）有限公司提供）；探针I I的碱基序列为5 '-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTCAGTCACGACGATTTTCCCTAACCCTAACCCTAACCC -3'(由宝生物工程(大连)有限公司提供）。
[0027] 采用上述探针I和探针II检测宫颈癌细胞(Hela)中的端粒酶活性，具体方法如下： [0028]将培养的他1&细胞从培养基中消化离心分离，用冷的0^^5缓冲溶液（1〇111111〇1/1磷 酸盐，O.lmol/L NaCl，pH 7.4)洗涤离心3次，然后以2000转/分离心511^11。洗涤后的细胞加 入冷的D-PBS缓冲溶液中，调节细胞浓度为lOOcell/yL。分别向100个(3组）、10个(5组)和1 个（10组)Hela细胞中加入lyL预冷的CHAPS细胞裂解缓冲溶液，在冰上放置30分钟，得到不 同浓度的Hela细胞裂解液，其中10个Hela细胞和1个Hela细胞是利用显微操作系统取出。 [0029]在200yL离心管中分别加入1.8yL水、0.5yL端粒酶反转录延伸反应缓冲溶液 (200mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2,630mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，0.5%吐温-20， pH=8.3，25°C)、1.OyL 2.5mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.5yL 2ymol/L探针I水 溶液、〇.2yL 40u