植物中非转基因基因组编辑方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2014年6月14日提交的美国临时申请序列号61/835,307的优先权。
技术领域
[0003] 本文设及植物分子生物学领域，并且具体提供了用非转基因方法产生基因组工程 改造的植物的材料和方法。
[0004] 背景
[0005] 传统植物培育策略已经发展多年W将需要的性状导入植物物种中，如增加的耐旱 性和作物产量。运类策略的缺陷在于它们一般需要连续多轮的杂交，并且因此可能花费多 年才能成功改变特定植物性状。随着转基因技术的出现，可能通过导入转基因构建体来工 程改造具有基因组变化的植物并因此避免了对传统植物培育的需要。然而，运些转基因技 术也具有几大缺陷。首先，向基因组中插入转基因（如由根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导）在很大程度上是随机的并且可能导致多次插入，运可能造成难W在分 离期间追踪不同染色体上存在的多个转基因。此外，由于其染色体环境，转基因的表达可能 是无法预测的，并且在许多情况中，转基因的表达是沉默的。另外，已经证明转基因植物的 生产是非常有争议的话题，公众的观点通常是反对产生运类变种，尤其是设及的变种是将 在广大地域上生长并用作人类消耗的食物的作物植物时。
[0006] 允许对植物基因组进行祀向修饰的方法可能克服运些问题中的前两个，从而可能 使转基因插入物祀向有助于基因表达的单个染色体位点，因此降低或消除多次转基因插入 和沉默事件的概率。已经使用经工程改造的锋指核酸酶(ZFN)在多个物种中证明祀向的基 因组修饰，其允许在预先选定的基因座处产生双链DNA断裂点并且W祀向的方式进行后续 的转基因插入(Xloyd等，2005;Wright等，2005; Townsend等，2009)。运一技术的一种变化是 简单使用ZFN来在选择的基因座处产生断裂点，然后允许通过NHEJ(非同源末端连接)来修 复DNA。在运一过程中，错误通常被引入新连接的区域(例如，核巧酸缺失)并且该方法能够 对选择的植物基因进行祀向诱变W及能够插入转基因构建体。
【发明内容】
[0007] 植物基因工程改造的上述优势并不必然减轻公众对经工程改造的植物物种的生 产和广泛生长的恐惧。因此，运一问题的解决方法是可W祀向的方式精确改变植物的基因 组而不使用传统转基因策略的方法。本发明通过提供对植物基因组的祀向、非转基因编辑 的方法提供了运种解决方案。运些方法更具体地依赖向植物细胞中导入蛋白质或mRNA形式 的序列特异性核酸酶，其异位到核中且作用是在预定基因座处精确切割DNA。切割修复期间 产生的错误使得能够导入功能损失(或功能获得)突变同时不向基因组中导入任何外源遗 传物质。
[000引通过运种方式，可产生不含残留的外源遗传物质的遗传修饰的植物物种。
[0009]在开发本文所述的方法之前，植物细胞的遗传修饰需要稳定基因组整合W体内表 达核酸酶或DNA修饰酶的转基因盒。一般通过农杆菌介导的植物物种转化来实现运类整合。 然而，如本文所述，可通过向植物细胞中导入纯化的核酸酶蛋白或编码运类核酸酶的mRNA 来实现稳定且可重复的基因组修饰。运是预料之外的效果，因为重组核酸酶或纯化的mRNA 不被认为足W对植物染色体或细胞器DM产生显著影响。此外，本文提供了基因组修饰的新 方案，并且也提供了适于实践本文所述的方法的序列和载体，并且产生经修饰的植物细胞 而不引入外源DNA。
[0010] 本文描述了使用非转基因策略编辑植物基因组的方法。向植物细胞中导入纯化的 核酸酶蛋白或编码该核酸酶蛋白的mRNA形式的序列特异性核酸酶(包括ZFN、寻祀核酸内切 酶、了4心效应子核酸酶、CRISPR相关系统[Cas9])。在CRISPR相关系统[Cas9]的情况中，核酸 酶可WmRNA或纯化的蛋白质的形式与用于祀位点识别的引导RNA-起导入。
[0011] 功能性核酸酶祀向特定序列，并且在预定基因座处切割细胞DNAdDNA损伤触发植 物细胞修复双链断裂。DNA修复期间产生的错误(例如，点突变或小插入/缺失)然后改变体 内DNA序列。
[0012] 与常规DNA转化不同，本文所述的基于蛋白质或RNA的基因组编辑策略特异性修饰 目标核酸序列并且不留下痕迹。由于在运些方法中没有使用外来DNA，该方法被认为是非转 基因植物基因组编辑。
[0013] 在一个方面中，本发明设及对植物基因组进行祀向遗传修饰而不插入外源遗传物 质的方法。本文可包括(i)提供含有待修饰的内源性基因的植物细胞，（ii)得到含序列识别 结构域和核酸酶结构域的序列特异性核酸；（iii)用序列特异性核酸酶转染植物细胞，和 (iv)在基因组中诱导一个或多个双链DNA断裂(DSB)W产生在植物基因组中具有可检测祀 向基因组修饰且不存在任何外源遗传物质的植物细胞。可通过非同源末端连接(NHEJ)来修 复 DSB。
[0014] 序列特异性核酸酶可W是TAL效应子-核酸酶、寻祀核酸内切酶、锋指核酸酶(ZFN) 或CRISPR-化s9核酸内切酶。可W纯化的蛋白质的形式，或纯化的RNA(例如，mRNA)的形式向 植物细胞中递送序列特异性核酸酶。
[0015] 序列特异性核酸酶还可含有一个或多个亚细胞定位结构域。运一个或多个亚细胞 定位结构域可包括SV40核定位信号、hnRNPAl的酸性M9结构域、PY-NLS基序信号、线粒体祀 向信号或叶绿体祀向信号。序列特异性核酸酶还可含有一个或多个细胞穿透肤结构域 (CPP)。运一个或多个CPP可包括反式激活转录激活(Tat)肤或化P-1CPP结构域。
[0016] 序列特异性核酸酶可与编码一种或多种外切核酸酶的一种或多种质粒共转染。一 种或多种外切核酸酶可包括TREX外切核酸酶家族成员（例如，TREX2)。
[0017] 待修饰的内源性基因可W是乙酷乳酸合酶基因（例如，ALS1或ALS2)，或液泡转化 酶基因（例如，马铃馨(Solanum tuberosum)液泡转化酶基因（VInv))。
[0018] 植物细胞可来自W下农作物物种:首猜、大麦、豆类、玉米、棉花、亚麻、魏豆、油菜、 水稻、黑麦、红花、高梁、大豆、向日葵、烟草、小麦。植物细胞可来自烟草(Nicotiana)属，或 来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0019] 可通过向分离的植物原生质体中递送序列特异性核酸酶来实现转染。例如，可使 用聚乙二醇(PEG)介导的转染、电穿孔、生物射弹介导的转染、超声波介导的转染、或脂质体 介导的转染向分离的植物原生质体中递送序列特异性核酸酶来实现转染。
[0020] 可在基因组中诱导一个或多个双链DM断裂之后通过同源重组机制来修复断裂。
[0021] 本文的特征还在于可按照本文提供的方法得到的转化的植物细胞，W及含有该植 物细胞的转化的植物。
[0022] 在另一个方面中，本发明设及用于对植物基因组进行祀向遗传修饰而不插入外源 遗传物质的试剂盒。该试剂盒可包含（i) 一种或多种蛋白质或mRNA形式的序列特异性核酸 酶，（ii)一种或多种植物原生质或完整培养的植物细胞，和任选的（iii)一种或多种编码一 种或多种外切核酸酶的DNA质粒载体。
[0023] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明， 但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文 献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，W本说明书(包括定义在内）为准。此外，材 料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
[0024] 在附图和W下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特 征、目的和优势通过描述、附图W及权利要求书将是显而易见的。
[0025] 附图简要说明
[0026] 图1是显示用于基因组工程改造的序列特异性核酸酶的结构组织的图。核酸酶含 有功能为能够进行细胞穿透、亚细胞蛋白质定位、DNA序列识别和DNA切割的结构域。
[0027] 图2是显示大肠杆菌化.coin中产生的转录激活因子样效应子内切核酸酶 (TALEN?)的SDS-PAGE的图片。ALS2T1L和ALS2T1R是祀向本赛姆氏烟草（Nicotiana benthamiana)ALS2基因中的位点的TALEN?nVInv7是祀向马铃馨VInv基因的紧密TALEN? (cT)〇
[0028] 图3是显示祀向本赛姆氏烟草ALS2基因的纯化的TALEN?的体外活性的琼脂糖凝胶 图。生成含有ALS2T1TALEN?的祀位点的PCR产物。PCR产物不与（-)或与（+ )纯化的ALS2T1L和 ALS2T1R解育。仅在存在两种蛋白质的情况下，PCR产物被切割。作为阴性对照，纯化的 ALS2T1L和ALS2T1R蛋白质与来自ALS1基因的PCR产物解育;没有观察到切割。
[0029] 图4的表格显示当W蛋白质形式向植物细胞递送时，I-Scel对附加体祀标的活性。
[0030] 图5的表格显示当W单独的蛋白质或与TreX联用的形式向植物细胞递送时，I-Scel对染色体位点的活性。用于该分析的454测序读数的总数量中的数字包括在第2列的括 号中。
[0031] 图6是在含有整合的I-Scel识别位点的转基因的普通烟草(N.tabacum)种系中I-Scel-诱导的突变的示例的序列比对。第一行（SEQ ID N0:8)表示I-Scel的识别位点的DNA 序列（下划线）。其他序列（SEQ ID N0:9至18)显示由不精确的非同源末端连接(NHEJ)诱导 的代表性突变。
[0032] 图7是总结在W不同形式（DNA或蛋白质）或处理组合转化到植物细胞中之后的 TALEN?ALS2T1诱变活性的图。
[0033] 图8是显示本赛姆氏烟草ALS2基因中TALEN? ALS2T1诱导的突变的示例的序列比 对。第一行（569 10^:19)显示41^521'1的识别位点的0魁序列（下划线）。其他序列（569 10 N0:20至31)显示由不精确的非同源末端连接(NHEJ)诱导的代表性突变。
[0034] 图9是显示用于体外mRNA产生的序列特异性核酸酶的结构组织的图。核酸酶构建 体含有Τ7启动子、核酸酶ORF和121-bp聚A尾。
[0035] 图10是描绘在YFP-基SSA试验中向植物原生质体递送的I-化el mRNA的切割活性 的图。SSA祀标质粒和P35S-I-化el或I-化el mRNA-起通过阳G-介导的转化共同递送到烟 草原生质体中。转化后24小时，使原生质体经流式细胞术来对YFP-阳性细胞的数量进行定 量。
[0036] 图11是本赛姆氏烟草中XylT_T04 TALEN?的祀序列(SEQ ID N0:32)。
[0037] 图12是再现向烟草原生质体递送Xyl_T04 TALEN? mRNA的454焦憐酸测序数据的 表格。第对兰中括号内的数字是所得的测序读数的总数*:通过用将NHEJ突变的454读数的百 分比标准化到原生质体转化效率来得到NHEJ诱变频率。括号中显示用于该分析的454测序 读数的总数。**:从仅由编码YFP的质粒转化的原生质体获得阴性对照。
[003引图13是显示在本赛姆氏