一类大环内酯类化合物及其制备方法和在制备抗海洋生物污损涂料中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于天然产物领域，具体涉及一类大环内酯类化合物及其制备方法和在制 备抗海洋生物污损涂料中的应用。
【背景技术】：
[0002] 大环内酯类化合物包括大环单内酯和大环多内酯，具有广泛的生物活性，其中大 环多内酯中一些对称的十六元环二内酯类化合物虽然结构较简单，但由于其结构的新颖性 和生物活性的显著性，吸引了许多有机合成研究者，而天然十八元环二内酯类化合物研究 相对较少。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的是提供一类具有抗海洋生物污损活性的大环内酯类化合物。
[0004] 本发明通过多种柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的发酵产物中分离得到一类新的大环内酯类化合物，这种化合物具有抗海洋生 物污损活性，可用于制备抗污损涂料，从而实现了本发明的目的。
[0005] 本发明的3个大环内酯类化合物，其结构如式(I)所示：
[0007] 本发明的第二个目的是提供如式（I)所示的大环内酯类化合物的制备方法，其特 征在于，包括以下步骤：
[0008] (1)制备真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021 的固体发酵物；
[0009] (2)将步骤（1)得到的固体发酵物用丙酮浸提，丙酮浸提液浓缩后得到丙酮浸膏， 丙酮浸膏再用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提 取物或氯仿提取物；
[0010] (3)将步骤(2)所述的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过中压、 常压硅胶柱层析，以水-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油 醚-乙酸乙酯溶剂系统分别作为正反相洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，用薄 层层析追踪合并组分，经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到粗品，经高效液相色谱纯化，得 到式(I)所示的大环内酯类化合物1-3;
[0011 ] 步骤（1)中所述的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的固体发酵物是通过将 真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021接种到真菌适用的培养基中，在通常的发酵条件下 制得。优选的制备方法是将真菌1'1'；[01101301:巧8 6€;^86 0??303021接种于?04琼脂培养基 中，28°C培养3天，得到培养有菌种的平板，然后将平板中菌种接种入液体培养基中，于转速 180r/min摇床、温度28°C培养3天，得到种子液，再将种子液接种于大米培养基中，于28°C静 置培养30天，得到真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的大米发酵产物，所述的液体培养 基为每升含有葡萄糖IOg，甘露醇20g，麦芽糖20g，玉米浆Ig，味精IOg，KH 2P04 0.5g，MgS04 0.3g，酵母浸膏3g，海盐30g，余量为水，pH 7.0，所述的大米培养基为:在每600ml水中，加入 大米400g，酵母膏2g，葡萄糖2g，海盐18g。
[0012] 本发明的第三个目的是提供真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021在制备上述大 环内酯类化合物1、2或3中的应用。
[0013] 通过体外抗海洋污损生物幼虫附着活性筛选实验，结果显示:本发明的如式（I)所 不的化合物1抑制藤壶幼虫和草苔虫幼虫附着的EC5Q值分别为7.3yg/mL和2.5yg/mL，LC5〇/ EC5Q值分别为大于40.5和37.4;化合物2抑制草苔虫幼虫附着的EC5q值为9.2yg/mL，LC 5Q/EC50 值为大于100;化合物2和3在浓度25yg/mL时抑制藤壶幼虫附着的抑制率分别为32 %和 41 %;化合物3在浓度25yg/mL时抑制草苔虫幼虫附着的抑制率为29%。可见，化合物1和2有 良好的抗海洋生物污损活性，化合物3有一定的抗海洋生物污损活性。
[0014] 因此，本发明的第四个目的是提供如式（I)所示的大环内酯类化合物在制备抗海 洋生物污损涂料中的应用。
[0015]所述的抗海洋生物污损涂料优选为抗藤壶幼虫或草苔虫幼虫附着涂料。
[0016] -种抗海洋生物污损涂料，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的所述的大 环内酯类化合物和可以接受的载体。
[0017]所述的抗海洋生物污损涂料优选为抗藤壶幼虫或草苔虫幼虫附着涂料。
[0018] 本发明的如式（I)所示的大环内酯类化合物能抑制藤壶幼虫和草苔虫幼虫的附 着。将本发明式（I)所示的大环内酯类化合物单独或组合渗入或扩散于成膜天然树脂，聚乙 烯乙酸乙酯共聚物以及其它可水解，可溶或不溶性树脂等聚合物中，制成抗污损涂料，抗污 损涂料能释放出足够量的有效成分至表面达到防污作用。这些化合物是天然活性成分，而 且均不易溶于水，极易溶于氯仿、乙酸乙酯等低极性有机溶剂，具有良好的亲油性，因此可 单独或组合应用于制备海洋防污剂中，具有良好的应用前景。
[0019] 本发明的Trichobotrys effuse DFFSCS021于2015年8月20日保藏于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号:CCTCC NO.M 2015496。
【附图说明】：
[0020] 图1是化合物1和2中的关键HMBC和1H-1H COSY图，其中1代表化合物1，2代表化合物 2；
[0021]图2是化合物1的水解和Morsher酯化产物；
[0022] 图3是化合物1的Morsher酯化产物的Δ δ(δ5-δκ)值。
【具体实施方式】：
[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] 实施例1:大环内酯类化合物1-3的制备
[0025]每升液体培养基是这样配制的:将10克葡萄糖，20克甘露醇，20克麦芽糖，1克玉米 浆，10克味精，0.5克KH2P〇4，0.3克MgS〇4，3克酵母浸膏，30克海盐混合，用水定容到IL，调pH 7.0。将液体培养基装入约5个500mL的三角烧瓶中，每瓶约150mL，在121°C高压蒸汽灭菌25 分钟。
[0026]大米培养基是这样配制的：每个5L三角瓶中盛装大米400g，酵母膏2g，葡萄糖2g， 海盐18g，用水定容到600mL，混匀，121°C高压蒸汽灭菌25分钟，共6瓶备用。
[0027] 用移液枪吸约2微升的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021菌种接种入PDA琼脂 培养基上，28°C培养3天，得到培养有菌种的平板，然后用竹签从平板中挑约3微升菌种接种 入含150mL上述液体培养基的500mL三角烧瓶中，于摇床(转速180r/min)温度28°C培养3天， 得到种子液后，在上述盛有大米培养基的5L三角瓶中接种50mL种子液，于28°C静置培养30 天后，收取发酵产物。
[0028]将经大米培养基培养得到的发酵产物每瓶用2L丙酮浸泡、捣碎，在用组织匀浆机 搅拌均匀，超声破壁30分钟，减压抽滤得到滤液，将滤液减压蒸馏除去丙酮后，再用水制成 水混悬液，再用20L乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物29.93g。乙酸乙酯提取物 用正相硅胶（200-300目）干法拌样后，装入玻璃层析柱(含正相硅胶200-300目约300g)，进 行常温柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，根据薄层 层析(GF 254硅胶板)情况合并得至1」7个流分(Fr. I-Fr.7)，回收洗脱溶剂，蒸干流分用甲醇转 移。其中在薄层层析板(GF254硅胶板)上用氯仿-甲醇(体积比8:2)能展开的流分Fr.5通过硅 胶柱(含正相硅胶100-200目约100g)进行常温柱层析，以体积比为20:1、10 :1、4:1、1:1的氯 仿-甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，根据薄层层析(GF254硅胶板)情况合并得到4个亚流分 $1'.5-1+1'.5-4)。其中含有在薄层层析板(6?254硅胶板)上用氯仿-甲醇(体积比8:2)展开 时Rf值大约〇. 4~0.7主点的流分Fr. 5-3进一步经过凝胶Sephadex LH-20柱层析，用CHCl3/ MeOH(I = I)洗脱合并得至丨」3个亚流分(Fr.5-3-1-Fr.5-3-3);其中含有在薄层层析板(GF254娃 胶板)上用氯仿 -甲醇(体积比8:2)展开时Rf值大约0.6~0.7主点的流分Fr. 5-3-1进一步经 过高效液相半制备（检测波长为254nm，流速为3mL/min，色谱柱为YMC-Pack IOmmX 250mm， 流动相为体积比为25:75的甲醇-水），接收出峰时间为16分钟的流分得到化合物1;其中含 有在薄层层析板(GF254硅胶板)上用氯仿-甲醇(体积比8: 2)展开时Rf值大约0.4~0.5主点 的流分?^5-3-2采用高效液相半制备（检测波长为254腦，流速为3111171^11，色谱柱为￥1(：-Pack IOmmX 250mm，流动相为体积比为15:85的甲醇-水)分别在出峰时间为53 · 0和58 · 0分 钟时分离纯化得到化合物3和2。
[0029]其中化合物1的结构解析如下：
[0030] 通过高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 423.1987[M+Na]+处给出准分子离子峰，结合 匪R波谱数据，得知化合物1的分子式为C2qH32O8i31H谱（表1)中显示分子中有甲基δ Η 1.05 (3H，d，J = 5.5Hz)，3个亚甲基δΗ 1.74(lH，m)，1.54-1.61(2H，m)，1.34-1.44(3H，m)，3个氧 次甲基3[13.92(1!1，111)，5.07(1!1，(1，了 = 6.0抱），3.55(1!1，111)，2个烯次甲基3[15.79(1!1，(1，了 = 15.5抱），6.62(1!1，(1(1，1 = 6.5，15.5抱）.13(：谱(表1)显示分子中有10个碳信号，包括1个甲基 (δ。22.4)，3个亚甲基(S c 30.4,27.1,40.9)，3个氧次甲基（Sc 69.3,69.9,62.6)，2个烯次 甲基（δ。120.6，150.3)，及一个酯基（δ。165.0).结合分子式，以上核磁数据说明该化合物 由二个对称的片段(A链和B链)组成。通过HSQC，HMBC，1H-1H COSY谱图数据分析（图1 )，确定 了化合物1的平面结构。化合物1的绝对构型进一步通过水解反应和MOSHER酯化反应（图2) (Arnone,A.；Nasini,G.；Pava,0.V.Phytochemistry 1998,48,507-510;Freire,F·;Seco, J.M.；Emilio,Q.；Riguera,R.J.Org.Chem.2005,70,3778-3790；Oh,D.C.；Scott,J.J.； Currie，C.R. ;(：1&"7，1.0邙.1^?.2009，11，633-636)得到确定，将酯化反应产物的&