基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方 法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质荧光标记是一种用于研究蛋白质结构和功能的重要手段。目前已有的荧光 标记技术大致包括以下几种：（1)基于焚光蛋白（如绿色焚光蛋白Green Fluorescent Protein GFP)融合表达进行蛋白质标记方法；（2)基于催化荧光基团（如罗丹明，FITC等)和 蛋白质的特定氨基酸残基(如半胱氨酸Cys或赖氨酸Lys)间形成共价键，实现蛋白质的焚光 标记；（3)基于化学或光"点击反应"，实现蛋白质定点荧光标记；（4)基于基因编码的香豆素 酪氨酸方法实现蛋白质的定点荧光标记。受技术条件所限，这几种技术方法都有一定的缺 陷：（1)荧光蛋白质（如绿色荧光蛋白质GFP)只能通过融合表达的方法标记在蛋白质的氮 (N)端或碳(C)端，无法在蛋白质氨基酸其他序列中实现标记;且由于GFP体积较大，会对蛋 白质结构和功能造成影响，其应用范围有限。（2)通过荧光基团和蛋白质氨基酸残基进行化 学反应实现蛋白质荧光标记的方法，无法做到单一位点特异性，对于研究蛋白质相互作用 具有一定的局限性。（3)基于"点击反应"的方法，需要化学或光照催化，会影响蛋白质的活 性。（4)基因编码香豆素酪氨酸的方法，可以做到定点荧光标记，由于香豆素酪氨酸具有较 强的量子产率，此方法可用于多种蛋白质的荧光标记，然而目前尚无法在真核生物里实现 香豆素酪氨酸的定点插入。而吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶可以在细菌和真核细胞中实现 穿梭，筛选特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶，可解决上述问 题。
[0003] 基于此，本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动 物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动物细胞）中实现目的蛋白质的氨 基酸序列的任意位点的荧光标记，旨在解决目前荧光标记方法无法实现真核生物蛋白质定 点荧光标记制备问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述 基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法包括如下步骤：
[0006] SI:获得M.Barkeri PyIRS突变库；
[0007] S2:获得香豆素赖氨酸；
[0008] S3:筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突变体；
[0009] S4:在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入7-羟基香豆素赖氨酸，验证筛选得到 的CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。
[0010] 优选地，所述步骤si包括如下步骤：
[0011] SI 1:人工合成M.Barkeri PyIRS的DNA序列；
[0012] S12:将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，获得重组质粒A;
[0013] S13:设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引物 f-L2701、引物r-L2701、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；
[0014] S14:以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D为引物，通过聚 合酶链式反应，获得突变库1;
[0015] S15:以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引物，通过聚合 酶链式反应，获得突变库2;
[0016] S16:以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为 引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3;
[0017] S17:以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过 聚合酶链式反应，获得突变库4;
[0018] S18:所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照预定的比例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。
[0019] 优选地，所述预定的比例为1:1:32:32。
[0020] 优选地，所述步骤S2包括如下步骤：
[0021] S21:取预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90°C，滴加预设量的苹果酸，反应2 小时后即可得到7-羟基香豆素 A;
[0022] S22:取预设量的上述7-羟基香豆素 A和赖氨酸于60°C搅拌，经过12小时，经液相色 谱分离，得到7-羟基香豆素母液C。
[0023] 优选地，所述香豆素赖氨酸B经过0.22微米滤膜过滤除菌。
[0024] 优选地，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。
[0025] 优选地，所述步骤S3包括如下步骤：
[0026] S31:构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒；
[0027] S32:构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒，进行转化和筛选，获得含有CouKRS的菌 株，该菌株特异识别7-羟基香豆素赖氨酸。
[0028]优选地，所述CouKRS的突变位点为L2701，Y349D，N311A，N313G。
[0029] 优选地，所述S4包括如下步骤：
[0030] S41:首先共转化 CouKRS-pBK 和 Myoglobin-4tag-pBAD 至 TOPlO 中；
[0031 ] S42:获得纯化的Myoglobin蛋白质；
[0032] S43:将上述S42中获得Myoglobin蛋白质在488nm激光激发下，发出焚光，即可验证 筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。
[0033]本发明提供的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法通过合成M.Barkeri物种的 吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上;通过 采用"饱和突变"的方法，构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡 咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变库Lib-CouKRS;通过合成用于定点荧光标记的7-羟基香豆 素赖氨酸，进行筛选和验证，达到了基于7-羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞）中实现 目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的流程示意图；
[0035] 图2为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤Sl的流程示意图；
[0036] 图3为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S2的流程示意图；
[0037] 图4为本发明香豆素赖氨酸的结构示意图；
[0038] 图5为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S3的流程示意图； [0039]图6为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S4的流程示意图。
【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解 释，本发明并不局限于以下实施例。
[0041] 本发明提供的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的 定点荧光标记方法是通过检测真核生物鲸鱼肌红蛋白插入了 7-羟基香豆素，所述鲸鱼肌红 蛋白在488nm激光激发下，发出荧光来实现的。
[0042] 在本实施例中，M.Barkeri表不一种产甲烧厌氧菌；PylRS(pyrrolysine aminoacyl-tRNA synthetase)中文为吡略赖氨酸氨酰-tRNA合成酶。
[0043] 在实施例中，如图1所示，图1为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的 流程示意图。野生型产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶）只识别吡咯赖氨 酸(第22种基因编码的天然氨基酸），并催化吡咯