基于微流控芯片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选共培养模型的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及微流控忍片技术和癌症研究等领域，具体地，是一种基于微流控忍片 研究不同程度癌症癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是目前严重困扰人类健康的世界性难题，据国际肿瘤研究机构公布的数 据显示每年全球约800万人死于恶性肿瘤，其中90%恶性肿瘤患者死于肿瘤转移，研究显示 肿瘤侵袭和转移过程为能更好地阐明肿瘤细胞迁移的机制和筛选出抑制肿瘤细胞迁移的 药物，建立一种灵活、可靠、低成本的细胞迁移模型具有重要意义。
[0003] 细胞迁移模型分为体内和体外模型，体外细胞迁移模型相比体内模型成本低、操 作简单，可避免动物实验所设及到的伦理问题，同时也可避免人类与实验动物种属特异性 差异造成实验结果不一致的现象。
[0004] 微流控忍片具有结构设计灵活和规模集成的优势，具有高通量、低消耗和操作自 动化的特点，是细胞操控和分析的有利技术平台。用于生物细胞培养的微流控装置多用娃、 聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃等制作。其中聚二甲基硅氧烷不仅具有生物兼容性、毒性低、 较高的化学和热稳定性、透光性、对水的渗透性低W及电导性低等特点。
[000引此外，近年来国内外在肿瘤转移研究方面进展较快，尤其是阐明了肿瘤转移的某 些关键环节和相关机理，但至今尚无广泛用于临床预防治疗肿瘤转移的药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种基于微流控忍片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培 养模型，本模型为研究癌细胞迁移的体外共培养模型，通过控制癌细胞与正常细胞的比例， 从而建立轻度、中度和重度的癌症模型，研究癌症的不同时期癌细胞的迁移状况。本模型也 可用于抗癌药物的筛选，尤其是抗癌细胞迁移的药物筛选，从而更好的拟制癌细胞的扩散。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案来实现： 一种基于微流控忍片研究不同程度癌症癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型，该 共培养模型由四层忍片叠加而成，所述四层忍片自下而上依次是玻璃片支撑层（1)、PDMS接 种细胞层(2XPDMS供液层(3)W及PDMS气动阀口控制层(4)，通过基于等离子清洗技术的键 合工艺组装成一体;其中，所述PDMS接种细胞层(2)上设有Ξ个细胞共培养腔室，用于研究 癌细胞和正常细胞不同比例下癌细胞迁移或抗癌药物筛选。
[0008] 优选实施例中，所述Ξ个细胞共培养腔室的每个细胞共培养腔室包括两个接细胞 腔室，一个腔室接入癌细胞，另一个腔室接入正常细胞，该两个接细胞腔室中间设置微流道 阵列（11)，由集成于所述PDMS供液层(3)和PDMS气动阀口控制层(4)上的一个气动控制阀口 (18)控制该微流道阵列（11)实现两个接细胞腔室的连通和闭合;控制所述Ξ个细胞共培养 腔室中癌细胞和正常细胞比例分别模拟轻度癌症、中度癌症和重度癌症，研究癌细胞的迁 移。
[0009] 所述Ξ个细胞共培养腔室中，一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（5) 和腔室(8)，另一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室(6)和腔室(9)，第Ξ个细胞共 培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（7)和腔室（10)，腔室（5)、（6)、（9)及（10)的面积相等， 腔室（8)与腔室（7)的面积相等并且是腔室（5)面积的两倍;腔室（5)、（6)、（7)分别接低浓 度、中等浓度及高浓度癌细胞，腔室(8)、（9)、（10)分别接入高浓度、中等浓度及低浓度的正 常细胞，腔室巧)和腔室(8)作为轻度癌症模型，腔室(6)和腔室(9)作为中度癌症模型，腔室 (7)和腔室（10)作为重度癌症模型。
[0010] 其中，所述微流道阵列（11)具有30-50个微通道，相邻微通道间隔40μπι，每一个微 通道的尺寸是40μπιχ25μπιΧ:400μπι(宽X高X长）。所述立个细胞共培养腔室采用相同规格的微 流道阵列，便于在一个标准下评价Ξ个细胞共培养腔室癌细胞的迁移能力。
[0011] 所述PDMS供液层（3)和PDMS气动阀口控制层(4)上集成了与所述Ξ个细胞共培养 腔室对应的Ξ个气动控制阀口（ 18)。所述气动控制阀口（ 18)包括位于所述PDMS气动阀口控 制层(4)中的一充气腔室（20)，与该充气腔室20连通的入气口（ 19) ; W及，设置于所述PDMS 供液层(3)的对应流道上的条状突起（16)，借助有无气体压力使该条状突起（16)下压接触 或脱离所述微流道阵列（11)实现细胞共培养腔室的两个接细胞腔室的闭合和连通。所述条 状突起（16)的高度为130μπι。所述充气腔室（20)大小是4細讯!，2級從χΟ L;掛m (长X宽X 局）。
[0012] 所述PDMS供液层(3)的设计基于Ξ个目标而进行:首先要确保接入细胞的均匀性， 使细胞能够均匀分布在细胞培养腔室;其次是为了保证供给培养液的均匀性，同时降低培 养液流速对细胞的影响；最后要保证营养液的供给充分。在所述PDMS供液层(3)下表面（即 与PDMS接种细胞层(2)相邻的一面)上设置与所述Ξ个细胞共培养腔室分别对应的流道，用 于接入细胞和供给培养液;在每个流道与其进夜口（ 14)、出液口（ 15)之间分别设有若干柱 状突起(17)，W保证供给培养液的均匀性，同时降低培养液流速对细胞的影响。
[001引所述PDMS供液层(3 )的厚度可W为0.2 5-0.3mm，设置于PDMS供液层(3 )上的供液流 道的深度是150μπι。所述PDMS供液层(3)上的流道适应于静态或动态地供给细胞培养液。
[0014] 当采用动态的供给培养液培养时，本共培养模型可W研究不同的培养液供给速度 下，癌细胞的迁移能力，进而模拟人体不同部位的癌细胞的迁移情况。
[0015] 本共培养模型可用于模拟癌细胞和正常细胞不同比例下癌细胞的迁移情况，W此 来用于不同程度的癌症的研究。也可W在此模型下进行抗癌药物的筛选，从而针对不同程 度的癌症选用不同剂量的药物，减少对正常细胞的杀伤，更好的治疗癌症;本模型可W进行 抗癌细胞迁移的药物研究。
[0016] 本共培养模型可直接放到二氧化碳培养箱中进行培养，从而保证稳定无菌的细胞 生长环境。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有W下优点： 本发明在四层忍片的设计上综合考虑了目前微流控片的加工工艺，具有多个细胞共培 养腔室、用于细胞迁移评价的微流道阵列W及集成于忍片的多个气动控制阀口，结构设计 精巧，制作工艺简单，可W实现批量化制作。
[0018] 在忍片的操作上，本模型控制简单易行，接种细胞和供给培养液方便，细胞生长和 迁移情况在显微镜下观察方便，忍片可直接放到二氧化碳培养箱中进行培养，从而保证稳 定无菌的细胞生长环境。
[0019] 在忍片的功能上，本忍片是正常细胞和癌细胞的共培养装置，更加仿生地模拟了 癌细胞再人体内的生长环境。同时集多种功能于一体，可W用于癌细胞迁移能力的研究和 抗癌药物的筛选，尤其是可W用于抗癌细胞迁移的药物研究；可W实现动态或静态的共培 养等。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明用于研究癌细胞迁移的体外共培养模型的结构示意图； 图2为图1中PDMS接种细胞层的结构示意及局部图； 图3为图1中PDMS供液层下面向上翻转后的结构示意及局部图； 图4为本发明用于研究癌细胞迁移的体外共培养忍片组装后的剖面图和一气动控制阀 口的结构示意图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明详细说明。
[0022] 如图1所示，本发明共培养模型为四层忍片结构，自下而上依次是玻璃片支撑层 (1)、PDMS接种细胞层(2)、PDMS供液层(3似及PDMS气动阀口控制层(4) dPDMS接种细胞层上 设Ξ个细胞共培养腔室，在PDMS供液层与PDMS接种细胞层相邻的一面上配置与所述Ξ个细 胞共培养腔室对应的流道，PDMS供液层和PDMS气动阀口控制层上集成了相应的Ξ个气动控 制阀 11 (18 )。
[0023] 忍片的加工组装通过W下步骤来实现： 首先，玻璃片支撑层（1)选用常用的光学玻璃，尺寸是y化&:<(长>：宽>： 高），在忍片组装前，必须对玻璃片进行充分的清洗，然后烘干使用。
[0024] 其次，PDMS接种细胞层(2)、PDMS供液层(3)W及PDMS气动阀口控制层(4)的加工是采 用常用的软光刻加工方法，运Ξ层结构先是用SU-8光刻胶再娃片上用光刻机制作出设计好的 图案;然后用PDMS娃橡胶(如现有的道康宁Sylgard DC184产品），将其主剂和固化剂分别W 10:1、20:1、5:1的比例配制成诱注液，诱注在各自的娃片模版上，即可制得带有微通道的忍片 基片。最终加工出来的PDMS接种细胞层(2 )、PDMS供液层(3 ) W及PDMS气动阀口控制层(4 )的 夕h形尺寸分另!]是51巧巧乂2至巧⑩Xi化化.'、《I始戚朱別妨泌戈々-油a撤'、《I猫化《2}化巧X2化從（长X 宽￥:髙）。最后通过基于等离子清洗技术的键合工艺来完成忍片的组装。
[0025] 如图2所示，PDMS接种细胞层(2)上设有Ξ个细胞共培养腔室，深度是25μπι。Ξ个细 胞共培养腔室中，每个细胞共培养腔室包括两个接细胞腔室，一个腔室接入癌细胞，另一个 腔室接入正常细胞，两个接细胞腔室中间设微流道阵列（11)，由集成在忍片上的气动控制 阀口（18)控制微流道阵列（11)进而实现两个接细胞腔室的连通和闭合。Ξ个细胞共培养腔 室均配置一个微流道阵列（11 )，微流道阵列（11)具有40个微通道，相邻微通道间隔40WI1排 列，每一个微通道尺寸是40μπιΧ25皿Χ400皿（宽X高X长）。^个细胞共培养