一种筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及重金属污染土壤生物修复技术领域，具体涉及一种筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法。
【背景技术】
[0002]随着工业的发展，水污染、土壤污染、大气污染日趋严重，其中，由于采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属超标制品等人为因素所导致的重金属污染由于其难以处理对人体健康造成了较为严重的危害。
[0003]重金属与有机物污染不同，很难被微生物降解，修复重金属污染土壤的途径之一是通过超富集植物吸附吸收。但由于植物根系环境中的微生物、根系、土壤酶、金属离子之间存在复杂的关系，所以需从植物根系及其周边环境中筛选出有益根际微生物。一方面，有益根际微生物会促进植物的生长、有助于提高植物的修复效率。如科学家把从污染土壤中分离的菌根菌接种到超富集植物蜈蚣草中，发现菌根菌的接种显著增加了植物对As的吸收和植物中的含As量。另一方面，有益根际微生物还具有对重金属毒性的抗性，能更好地适应重金属污染环境，且不会对生态系统造成二次污染。因此，筛选促进重金属植物修复的根际细菌是重金属污染土壤修复技术的一个重要领域。目前，传统的筛选方法是采用液体摇瓶培养法筛选，这种方法存在的主要缺点是仅能筛选到在悬浮液体中快速生长的微生物，而具有吸附特性的根际有益菌很难被筛选到。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法，用于解决采用现有的液体摇瓶培养法仅能筛选到在悬浮液体中快速生长的微生物，而很难筛选到具有吸附特性的根际有益菌的问题。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:一种筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法，包括如下步骤:
[0006](I)对植物和土壤样品进行采集操作和预处理操作；
[0007](2)经步骤(I)采集后的样品进行富集处理；
[0008](3)经富集处理后的培养物进行初筛操作；
[0009 ] (4)对初筛后的培养物进行分离处理；
[0010](5)分离得到的菌种进行复筛操作；
[0011]所述步骤(2)的富集处理包括富集瓶制作过程、向富集瓶中加入样品过程和菌种培养过程，所述富集瓶制作过程中需向试剂瓶中加入吸附载体、重金属化合物、营养肉汤和制霉菌素。
[0012]相比于现有技术，本发明所述的筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法具有以下优势:本发明首先对植物和土壤样品进行采集和预处理，之后对其进行富集处理，并在富集瓶的制作过程中加入吸附载体、重金属化合物、营养肉汤和制霉菌素，其中，营养肉汤和制霉菌素是为了供给给细菌营养和在富集过程中起到抗霉菌的作用。本发明相对于传统的方法还在富集过程中添加有吸附载体和重金属化合物，吸附载体的添加能使易吸附的菌种大部分均吸附在吸附载体上，方便后期对于固体物质的处理和对于菌种的提取分离，也更易于对吸附性强的菌种的提取，重金属化合物的添加在富集瓶中使细菌形成了一个偏食的环境，促进细菌吸附重金属化合物特性的显现。在富集处理后对得到的固体物质进行初筛和分离。最后，通过富集植物培育直接复筛及验证，观测植物生长状况及检测植物体内重金属的含量，筛选到有促进植物对重金属吸附吸收功能的有益菌。
[0013]本发明提供了一种直接、有效筛选促进重金属植物修复根际细菌的新方法，该方法能更快更准确地筛选到有促进植物对重金属吸附吸收功能的有益菌，提高了筛选效率。使筛选出的具有吸附特性的根际有益菌接种到植物后对重金属污染具有更强的治理能力。
【附图说明】
[0014]通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中:
[0015]图1示出了根据本发明所述的筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法的步骤流程图。
【具体实施方式】
[0016]本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上下文中。在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的【具体实施方式】的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。
[0017]下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
[0018]本发明提供一种筛选促进重金属植物修复根际细菌的方法，首先，对植物和土壤样品进行采集操作和预处理操作，其中采集操作为采集重金属污染严重场地上的生长较好的植物样品，包括植物样品的完整根系及其根系的周边土壤，一般需采集根系周边2_内的土壤，若采集地距离研究地距离较远，则采集到的样品需处于2?5°C的环境下保存。在对采集样品开始处理前先对其进行预处理步骤，即采用无菌水对采集样品进行初步冲洗，以冲洗掉杂质及吸附性较差的菌种。
[0019]然后，对预处理后的样品进行富集处理。在富集处理中首先制作富集瓶:将活性炭、稻壳、珍珠岩或玉米秸杆等吸附性较强的物质中的一种或多种作为吸附载体，将其粉碎至最长边小于Icm后投入试剂瓶中，投入量为15?20g，为了使富集中的富集空间较大，并避免富集瓶中的物质过快地挥发，选用150ml的三角瓶作为试剂瓶，此时吸附载体加入的量能正好遮盖住三角瓶的底部。吸附载体的添加能使易吸附的菌种大部分均吸附在吸附载体上，后期对于固体吸附载体进行处理便能提取出吸附性较强的菌种，从而方便了后期对于菌种的提取分离，提高了筛选的效率，并使筛选出了具有吸附特性的根际有益菌接种到植物后对重金属污染具有更强的治理能力。再加入适量的重金属化合物，重金属化合物的加入量为使重金属化合物在营养肉汤中的浓度为采集地污染土壤中重金属浓度的8?12倍，优选为10倍，重金属化合物的添加在富集瓶中使细菌形成了一个偏食的环境，促进细菌吸附重金属化合物特性的显现。为了避免富集瓶中的物质聚集凝结，在富集瓶中还加入少量的玻璃珠，以2?3颗为宜。在向富集瓶中加入供给菌体营养的营养肉汤50ml后对其进行灭菌处理，灭菌温度为121°C，灭菌时间为20min;灭菌结束，富集瓶自然降温至室温后再向富集瓶中加入2.0?3.0mg的制霉菌素，优选为2.5mg，此富集瓶的制作便完成。
[0020]其中，上述营养肉汤的配方为:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水100ml，调制pH为7.2 ±0.2。
[0021]取用经预处理操作后的植物根系及根系的周边土壤，将根系剪断后迅速转移到上述制作形成的富集瓶中，进行摇床培养，在摇床培养中控制富集瓶的环境温度为30°C，每分钟旋转150?180转。上述植物根系及根系周边土壤的量控制在使其能完全沉浸在富集瓶中的营养肉汤中为宜。每5天将前一富集瓶中的固体物质的50%转移到后一富集瓶中，即第一个富集瓶在经过5天的摇床培养后，将第一个富集瓶中的固体物质的50%转移到第二个新富集瓶中，在第二个富集瓶在经过5天的摇床培养后，将第二个富集瓶中的固体物质的50%转移到第三个新富集瓶中，按照上述顺序依次转移，共培养30?60天。
[0022]取出经富集培养得到的最后一个富集瓶中的固体吸附载体，对其进行初筛和分离操作，采用无菌水冲洗掉附着的土壤颗粒和非吸附性菌体，置于固体培养基平板上，上下涂抹，置于培养箱中进行培养，培养箱温度设定为30°C，培养5天。固体培养基平板从培养箱中取出，将载体周围的菌苔刮下，并在上述固体培养基平板上划线分离出单菌落，采用斜面培养基以斜面保存。
[0023]其中，固体培养基的配方为:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，重金属化合物的加入量为使所述重金属化合物在蒸馏水中的浓度是采集地污染土壤中重金属浓度的8?12倍，调制固体培养基pH为7.2 ± 0.2;
[0024]斜面培养基的配方为:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂20g，蒸馏水100ml，并使斜面培养基的pH为7.2 ±0.2。
[0025]进一步，需对分离得到的各种菌体进行复筛操作，为了避免试剂瓶中的液体挥发过快，复筛操作中的试剂瓶也选用150ml的三角瓶，先取用一个三角瓶，在三角瓶中对易栽种的富集植物进行培养，如绿萝、彩叶草等，一般在三角瓶中加入10ml的水进行培养备用。
[0026]经初筛分离得到的各种菌种分别接种到营养肉汤中进一步进行摇床培养，所选用的每份营养肉汤为1ml，摇床培养中，环境温度为30°C，以150r/min进行旋转，培养48h。培养得到的菌种采用无菌生理盐水稀释到浓度为OD66q = 0.3，备用。
[0027]将每个已培养植物的三角瓶中添加重金属化合物，其中，上述重金属化合物可为氯化锌、硫酸锌、氯化铜等，每个三角瓶中分别添加经稀释的菌液，在固定好植物后进行摇床培养，摇床培养的温度控制为30°C，60r/min，并培养30?60天，在培养过程中每天向三角瓶中补充无菌水保证植物根系浸泡在液面以下，培养后观测植物的生长状况并通过火焰原子分光光度法检测植物体内重金属的含量从而筛选出能促进重金属植物修复的根系有益菌。每种菌种可做多次复筛实验，从而计算出植物体内吸附的重金属含量的平均值。
[0028]实例
[0029]采集湖北大冶重金属污染严重场地上生长较好的植物作为样品按照本发明的方法进行实验，实验过程记录在以下菌体实验和对比实验中，