重组菌株及其制备方法、用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物领域，特别设及重组菌株及其制备方法、用途。
【背景技术】
[0002] k苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加 及药物辅助材料制备等。目前k苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于k苏氨 酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌 株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型 (日本专利申请公开号224684/83;韩国专利申请公开号8022/87)
[0003] 随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。 2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸 操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因 thrABC表达，苏氨酸生 产；^提高22% cKwan邑 Ho Lee(Kwan邑 Ho Lee等，Systems metabolic en邑ineerin邑 of Escherichia coli for ktbeonine production,Mol Syst Biol.2007;3:149)等利用系 统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和HI的基因 thrAJysC解除产物反馈抑制， 通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因 metA和 lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产 酸82.4g/L，糖酸转化率39.3 %。
[0004] 传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产 菌株。多数现有利用基因工程手段改造菌株都携带工程质粒来过表达氨基酸生物合成途径 中的关键基因，但是由于质粒在传代过程中容易丢失，不能够稳定表达且对菌株造成生长 负担。
【发明内容】
[000引有鉴于此，本发明提供重组菌株及其制备方法、用途。该菌株中thrA*BC的过表达 增强了心苏氨酸生物合成途径，t化的敲除阻断了心苏氨酸降解产物甘氨酸的形成。
[0006 ]为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007]本发明提供了重组菌株，其包含编码突变化rA蛋白质的突变thrA基因；所述突变 TlirA蛋白质具有S345P突变。
[000引在本发明的一些具体实施方案中，重组菌株还包括编码突变化rA蛋白质的突变 t化基因；所述突变t化基因为敲除t化基因。
[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，重组菌株还包括过表达突变thrA基因、编码 化巧蛋白质的t虹B基因与编码化rC蛋白质的thrC基因的重组基因；所述突变化rA蛋白质具 有S345P突变。
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，重组菌株的出发菌株为野生型W3110。
[0011] 在本发明的另一些具体实施方案中，重组菌株的保藏编号为CGMCC No. 11939。
[0012] 本发明还提供了所述重组菌株发酵生产苏氨酸中的应用。
[0013] 本发明提供了一种保藏编号为CGMCC齡.11939的心苏氨酸基因工程生产菌的构 建方法，包括如下步骤：
[0014] W野生型W3110为出发菌株；
[0015] 步骤A、通过在thrA中引入点突变S345P;
[0016] 步骤B、在步骤A构建获得的菌株中敲除tdh基因；
[0017] 步骤C、增加 thrA*BC拷贝数。
[0018] 本发明提供了一种保藏编号为CGMCC齡.11939的心苏氨酸基因工程生产菌的构 建方法，包括如下步骤：
[0019] W野生型W3110为出发菌株；
[0020] 步骤A、通过在t虹A中引入点突变S345P;
[0021] 步骤B、在步骤A构建获得的菌株中敲除tdh基因；
[0022] 步骤C、在步骤B构建获得的菌株中的t化位点插入t虹A地C。
[0023] 本发明还提供了一种发酵生产心苏氨酸的方法，发酵菌株为所述的重组菌株或如 本发明所述方法构建的重组菌株。
[0024] 在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵生产心苏氨酸的方法为取所述重组菌 株活化，在种子培养基中培养后，转接到发酵培养基。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵生产心苏氨酸的方法，其特征在于，W g/U十，
[0026] 所述种子培养基包括： 成分 浓度 葡萄糖 25 玉米浆 25 豆柏水解液 7.7
[0027] 酵母膏 2.5 KH.PO-i 1.4 七木硫酸緩 0.5 FcS〇4、MnS〇4 20 mg/L pH 7.0:
[0028] 所述发酵培养基包括： 成分 浓度 甘油 30 玉米浆 6 豆柏水解液 7.7 七水硫跋缓 0.5
[0029] KH2PO4 1.0 天冬氯酸 10 FcSOj、MnS〇4 30mg/L 生物素 50 pg 硫胺素 500 yg pH 7 2 。
[0030] 根据大肠杆菌中心苏氨酸的代谢路径，本发明W野生型W3110为出发菌株，在其基 因组上进行相关改造，无工程质粒负担，对苏氨酸代谢路径中关键基因进行相应的过表达 或失活，如强化thrA*BC、敲除t化，其中thrA*BC的过表达增强了レ苏氨酸生物合成途径， t化的敲除阻断了心苏氨酸降解产物甘氨酸的形成。
[0031 ] 实验结果表明，W3110菌株发酵不产苏氨酸，MHZ-0213-3菌株产苏氨酸为4.2g/L、 转化率约8.9%。本发明所述新型大肠杆菌，无质粒负担，构建方法简便且k苏氨酸产量高 于对照菌株，表明其可W应用于k苏氨酸发酵及后续研究。
[0032] 生物保藏说明
[0033] 生物材料MHZ-0213-3,分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli于2015年12月 25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 11939。
【具体实施方式】
[0034] 本发明公开了重组菌株及其制备方法、用途，本领域技术人员可W借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应 用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0035] 根据大肠杆菌中心苏氨酸的代谢路径，本发明W野生型W3110为出发菌株，在其基 因组上进行相关改造，无工程质粒负担，对苏氨酸代谢路径中关键基因进行相应的过表达 或失活，如强化thrA*BC、敲除t化，其中thrA*BC的过表达增强了レ苏氨酸生物合成途径， t化的敲除阻断了心苏氨酸降解产物甘氨酸的形成。
[0036] 本发明提供的重组菌株及其制备方法、用途中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0037] 大肠杆菌W3110突变菌株的从头构建工作，利用了Jiang Y等报道的文献中 CRISPR-Cas9方法（Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-化s9 System,Jiang Y,Qien B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)进行大肠 杆菌基因组上的遗传操作。
[0038] W下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50yg/mL，所述壮观霉素在培 养基中的终浓度为50yg/mL。^下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转 化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为W3110,属于埃希氏菌属化schericMa)。实施例中使用 引物序列见下表。
[0039]
[0040] 本发明中设及的基因名称解释如下：
[0041 ] t虹A:天冬氨酸激酶及I-高丝氨酸脱氨酶；
[0042] thrB:高丝氨酸激酶；
[0043] t虹C:苏氨酸合成酶；
[0044] t化:心苏氨酸脱氨酶。
[004引下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0046] 实施例 1:制备突变thrA* (S345P)基因的菌株W3110 (thrA* (S345P))
[0047] (1)构建 pTargetT-t 虹 A* (SSASP)质粒
[004 引 引物对gRNAthrAup-fl/排 NAthrAdn-rlWpTargetT质粒（来源于文献 Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y, 化en B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)为模板扩增出thrA的s排NA片段；引物对 thrA叩-f 1/thrA叩-rl WW3110基因组为模板扩增出thrA左片段，引物对thrAdn-f 1/ t虹Adn-rlWW3110基因组为模板扩增出thrA右片段;对3个片段进行OE-PCR扩增得到gRNA- thrA片段(全长0.化b)，Wspel/PstI进行酶切，插入到质粒pTargetT的相同酶切位点中，获 得 pTargetT-t 虹 A*(S345P)质粒。
[0049] (2)感受态细胞制备及电转pTargetT-t虹A*(S345P)质粒
[0050] 将pCas质粒（来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015) 转化入W3110感受态细胞中（转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》），挑取 W3110(p化S)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为lOmM阿拉伯糖的LB试管中，30°C20化/min 培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》）。
[0051 ] 将pTargetT-thr