一种体外扩增脐血cd34+细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体是涉及一种体外扩增脐血⑶34+细胞的方法。
【背景技术】
[0002]自1989年世界上首例脐血移植成功以来，人们己经对脐血移植进行了深入广泛的研究。但到目前为止，脐血移植仍存在一些尚待解决的问题，主要在于脐血造血干/祖细胞(CD34+)数量少，使其目前主要应用于儿童患者，限制了其广泛应用。因此，如何扩増脐血造造血干/祖细胞数量提高其植入率，缩短造血重建恢复时间，己经成为目前人们对脐血移植研究的主要问题。
[0003]对脐血⑶34+细胞的体外扩増，最初主要通过体外加入不同组合的细胞因子来达到扩増的目的，但体外加入的细胞因子不能长期维持细胞的培养，需要不断加以补充。之后，又建立了以骨髓基质细胞为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩増共培养体系，模拟体内造血微环境，以长期持续地分泌细胞因子来维持脐血CD34+细胞的扩増。然而，人骨髓基质细胞来源受限且脐血CD34+细胞与成人骨髓CD34+细胞具有不同的生物学特性。
[0004]因此，如何扩増脐血造造血干/祖细胞数量，提高其植入率，缩短造血重建恢复时间，己经成为目前人们对脐血移植研究的主要问题。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题是针对以上不足，提供一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，为脐血CD34+细胞的的扩增建立适合的培养条件，提高其植入率，缩短造血重建恢复时间。
[0006]本发明的技术方案是，一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，包括以下步骤:
[0007](I)脐血的采集及预处理:
[0008]无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30?50ml，加入肝素抗凝，以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介，将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:
1.5d的比例混匀，-15°c冷藏30分钟；
[0009](2)脐血的分离:
[0010]预处理后的脐带血与Hank’s液按体积比例为2:1混合，取一10ml离心管，加入Ficol1-Paque分离液15?25ml，将脐带血混合液30?50ml缓慢加于分离液上，1800r/min,离心16?20min，离心结束后，离心管中液体分层，吸取白色雾状单个核细胞层到一新10ml离心管中；
[0011](3)脐血CD34+细胞的纯化:
[0012]用红细胞裂解液(ACKLysis Buffer)除去红细胞，再用PBS清洗单核细胞2?3次，计数，按I X 17个细胞/ml的密度接种到含培养基I的75cm2培养瓶中；使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞；
[0013](4)脐血⑶34+细胞体外扩增培养:
[0014]脐血CD34+细胞重悬于培养基Π中，按I X 10Vml接种于6孔板中，每孔2.5ml，在37°C、5 % CO2饱和湿度条件下培养4周，每周半量换液一次；
[0015](5)测定⑶34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力:
[0016]吸取足量的培养基m到注射器中，并分装到灭菌试管中，按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基m中，扭紧试管盖，振摇试管，以保证所有的成份充分混匀，用頂DM+2%FBS稀释至合适浓度，在6孔培养板中每孔接种2 X 13个细胞，37°C，5 % CO2和饱和湿度条件下培养培养2周，在倒置显微镜下直接计数，40个以上细胞为I个集落。
[0017]进一步地，所述培养基I是由基础培养基和添加成分组成，所述基础培养基为RPMI1640培养液，所述添加成分为:谷氨酰胺I?2.5ug/mL、i3-巯基乙醇1%(ν/ν)、碳酸氢钠2?3.5ug/mL、膜岛素I?5ug/mL、bFGF 15?18ng/mL、维生素C 30?50ug/mL。
[0018]进一步地，所述培养基Π配方如下:50?120ml胎牛血清、10?25ml非必需氨基酸，Iml谷氨酰胺、2?8μ1β-巯基乙醇、1.0?1.5ml胰岛素、I?4μ1Ν-乙酰-L-半胱氨酸、3?20yg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、I?5yg肥大细胞生长因子(MGF)、0.2?1.0yg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、0.3?2.0yg白细胞介素8、重组人白介素-11。细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8—起诱导细胞增生、延长其存活期。
[0019]进一步地，所述培养基ΙΠ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子，所述重组细胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-ll 10ng/ml、IL-Ιβ 10ng/ml、EP0 6U/ml。
[0020]本发明与现有技术相比，有益效果体现为:采用发明的培养方法脐血细胞培养4周后，可大大扩増脐血⑶34+细胞和CFC，脐血⑶34+细胞扩増倍数在地2周可达(9.0 士4.5)倍，CFC扩増在第I周时达到峰值，说明本发明建立的培养体系及其培养条件对脐血CD34+细胞的扩增具有明显的支持作用。
【具体实施方式】
[0021]实施例1:
[0022]一种体外扩增脐血⑶34+细胞的方法，包括以下步骤:
[0023](I)脐血的采集及预处理:
[0024]无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30ml，加入肝素抗凝，以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介，将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混匀，-15°C冷藏30分钟；
[0025](2)脐血的分离:
[0026]预处理后的脐带血与Hank’s液按体积比例为2:1混合，取一10ml离心管，加入Ficol 1-Paque分离液15ml，将脐带血混合液30ml缓慢加于分离液上，1800r/min，离心16min，离心结束后，离心管中液体分层，吸取白色雾状单个核细胞层到一新10ml离心管中；
[0027](3)脐血⑶34+细胞的纯化:
[0028]用红细胞裂解液(ACKLysis Buffer)除去红细胞，再用I3BS清洗单核细胞2次，计数，按I X 17个细胞/ml的密度接种到含培养基I的75cm2培养瓶中；所述培养基I是由基础培养基和添加成分组成，所述基础培养基为RPMI1640培养液，所述添加成分为:谷氨酰胺Iug/mL、0-巯基乙醇I % (v/v)、碳酸氢钠2ug/mL、胰岛素l/mL、bFGF 15ng/mL、维生素C 30ug/mL；使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞；
[0029](4)脐血⑶34+细胞体外扩增培养:
[0030]按下述配方配制培养基Π:50ml胎牛血清、1ml非必需氨基酸，Iml谷氨酰胺、2μ1β-巯基乙醇、1.0ml胰岛素、ΙμΙΝ-乙酰-L-半胱氨酸、3yg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、Iyg肥大细胞生长因子(MGF)、0.2yg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、0.3yg白细胞介素8、重组人白介素-11，细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8—起诱导细胞增生、延长其存活期；脐血CD34+细胞重悬于培养基Π中，按I X 1fVml接种于6孔板中，每孔2.5ml，在37°C、5% CO2饱和湿度条件下培养4周，每周半量换液一次；
[0031 ] (5)测定⑶34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力:
[0032]吸取足量的培养基ΙΠ到注射器中，所述培养基ΙΠ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子，所述重组细胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-ll 10ng/ml、IL-Ιβ 1ng/mKEPO 6U/ml;然后分装到灭菌试管中，按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基ΙΠ中，扭紧试管盖，振摇试管，以保证所有的成份充分混匀，用MDM+2%FBS稀释至合适浓度，在6孔培养板中每孔接种2 X 13个细胞，37°C，5 %CO2和饱和湿度条件下培养培养2周，在倒置显微镜下直接计数，40个以上细胞为I个集落。
[0033]实施例2:
[0034]一种体外扩增脐血⑶34+细胞的方法，包括以下步骤:
[0035](I)脐血的采集及预处理:
[0036]无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血40ml，加入肝素抗凝，以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介，将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混匀，-15°C冷藏30分钟；
[0037](2)脐血的分离:
[0038]预处理后的脐带血与Hank ’ s液按体积比例为2:1混合，取一 1 OmI离心管，加入Ficol 1-Paque分离液20ml，将脐带血混合液40ml缓慢加于分离液上，1800r/min，离心18min，离心结束后，离心管中液体分层，吸取白色雾状单个核细胞层到一新10ml离心管中；
[0039](3)脐血⑶34+细胞的纯化:
[0040]用红细胞裂解液(ACKLysis Buffer)除去红细胞，再用I3BS清洗单核细胞2次，计数，按I X 17个细胞/ml的密度接种到含培养基I的75cm2培养瓶中；所述培养基I是由基础培养基和添加成分组成，所述基础培养基为RPMI1640培养液，所述添加成分为:谷氨酰胺1.75ug/mL、0-巯基乙醇I % (v/v)、碳酸氢钠2.75ug/mL、胰岛素3ug/mL、bFGF 16.5ng/mL、维生素C 40ug/mL;使用磁性细胞分选仪和⑶34+细胞分选试剂盒分离和纯化⑶34+细胞；
[0041 ] (4)脐血⑶34+细胞体外扩增培养:
[0042]按下述配方配制培养基Π:850ml胎牛血清、17.5ml非必需氨基酸，Iml谷氨酰胺、5μ?β-巯基乙醇、1.251111胰岛素、2.5411乙酰-1^-半胱氨酸、11.548细胞因子61-03?(购于美国PeproTech公司)、3yg肥大细胞生长因子(MGF)、0.6yg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、1.15yg白细胞介素8、重组人白介素-11，细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8—起诱导细胞增生、延长其存活期;脐血CD34+