乌塌菜总rna的高效提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物RNA的提取工艺，具体地说，设及乌塌菜总RNA的高效提取方法。
【背景技术】
[0002] 乌塌菜又名塌菜、黑菜等，为十字花科芸臺属白菜亚种的一个变种，W墨绿色叶片 供食，主要分布于我国长江流域。目前，针对乌塌菜的分子生物学研究，尚未建立适宜的RNA 提取方法。
[0003] 乌塌菜细胞在细胞壁破碎后，所含多糖、蛋白质等次生代谢物W不同方式干扰RNA 的提取，细胞内W及操作体系中存在的RNA酶将会对分离组织中的RNA进行降解，从而影响 后续研究。本发明在充分借鉴十字花科其他作物RNA提取方法的基础之上，建立了乌塌菜总 RNA高效提取方法。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种获得高纯度高浓度无降解的乌塌菜总RNA的高效提取方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的乌塌菜总RNA的高效提取方法，包括W下步 骤：
[0006] 1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)加入液氮快速研磨成粉末，倒入离屯、管中；
[0007] 2)向上述粉末中加入化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中震荡后室溫静置，然 后4°C离屯、；
[000引3)将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加氯仿，震荡后室溫静置，然后4°C离 屯、；
[0009] 4)将上清液转移至另一离屯、管中，加异丙醇上下颠倒摇匀，-20°C静置后，4°C离 屯、；
[0010] 5)弃去上清液，用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀，4°C离屯、，弃去上清液，RNA置于超净 工作台室溫干燥后(注意不要过分干燥），用不含RNA酶的灭菌水溶解，-80°C保存。
[0011] 前述的方法，步骤1)具体为:取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)〇.lmg，剪碎后，分2-3次加 入15-20mL液氮，在3-5min内迅速将叶片充分研磨成粉末，操作在超净工作台上完成(避风 环境）。
[0012] 前述的方法，步骤2)具体为：向步骤1)的粉末中加入1-1.5mL化izol裂解液，将离 屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫静置3-5min，然后4°C，12000巧m离屯、3-5min。
[0013] 前述的方法，步骤3)具体为:将步骤2)所得上清液置于另一离屯、管中，向上清液中 加0.15-0.3mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈摇荡15-30S后，室溫静置3-5min，然后4°C， 13000巧m 离屯、5-15min。
[0014] 前述的方法，步骤4)具体为:将步骤3)所得上清液转移至另一离屯、管中，加等体积 的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静置3-5min，然后4°C，13000巧m离屯、5-15min。
[0015] 前述的方法，步骤5)具体为:弃去上清液，RNA沉淀用0.5-1.0血75 %乙醇冲洗2次， 然后4°C，13000巧m离屯、3-5min;弃去上清液，RNA沉淀再用ο. 5-1.5mL无水乙醇冲洗1次，然 后4°C，13000巧m离屯、3-5min;去除乙醇，RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min，然后用不含 RNA酶的灭菌水SO-lOOiiL溶解，-80°C保存。
[0016] 优选地，所述方法包括W下步骤：
[0017] 1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在3min内将叶 片研磨成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）；
[0018] 2)向上述粉末中加入ImL化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫 静置3min，然后4°C，12000巧m离屯、5min;
[0019] 3)将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加0.2mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈 摇荡20s后，室溫静置5min，然后4°C，13000巧m离屯、lOmin;
[0020] 4)将上清液转移至另一离屯、管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静 置 5min，然后 4°C，13000巧m 离屯、lOmin;
[0021] 5)弃去上清液，RNA沉淀用0.8血75%乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离屯、5min; 弃去上清液，RNA沉淀再用1. OmL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000巧m离屯、5min;去除乙醇， RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min(注意不要过分干燥），然后用不含RNA酶的灭菌水80化 溶解，-80°C保存。
[0022] 本发明基于目前从乌塌菜中提取植物总RNA存在的诸多问题，提供一套科学系统 地提取高浓度高纯度的乌塌菜总RNA的方法，获得的高浓度高纯度的基因组RNA有利于后续 研究的深入。
[0023] 本方法具有W下优点：
[0024] ( - )加快研磨速度。通过向乌塌菜叶片中加入液氮，既提高了研磨效率，又可避免 研磨过程中污染所导致的RNA降解。
[0025] (二)加入裂解液震荡后再静置，可使组织裂解更彻底。
[00%] (Ξ)通过提高离屯、转速，使提取率更高。
[0027](四）用不同浓度乙醇洗RNA沉淀，可提高RNA纯度。
[00%](五)节省了提取时间。采用本方法仅需50-55min即可完成乌塌菜总RNA的提取。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例4中采用不同方法提取乌塌菜总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果； 其中，1为普通化izol提取法，2为试剂盒提取法，3为实施例1的高效提取法。
【具体实施方式】
[0030] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0031] 实施例1乌塌菜总RNA的高效提取方法
[0032] 1、取乌塌菜新鲜嫩叶0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在3min内将叶片研磨 成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）。
[0033] 2、向上述粉末中加入ImL化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫 静置3min，然后4°C，12000巧m离屯、5min。
[0034] 3、将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加0.2mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈 摇荡20s后，室溫静置5min，然后4°C，13000巧m离屯、lOmin。
[0035] 4、将上清液转移至另一离屯、管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静 置 5min，然后 4°C，13000巧m 离屯、lOmin。
[0036] 5、弃去上清液，RNA沉淀用0.8血75%乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离屯、5min; 弃去上清液，RNA沉淀再用1. OmL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000巧m离屯、5min;去除乙醇， RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min(注意不要过分干燥），然后用不含RNA酶的灭菌水80化 溶解，-80°C保存。
[0037] 实施例2乌塌菜总RNA的高效提取方法
[0038] 1、取乌塌菜新鲜嫩叶0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在5min内将叶片研磨 成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）。
[0039] 2、向上述粉末中加入1.2mL Trizol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中