一种鉴定鸟类性别的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒及其专用引 物。
【背景技术】
[0002] 全世界的鸟类中有50%是单态性鸟，其性别无论是幼鸟还是成鸟都很难从外观及 其他行为上区分，运给配对造成了相当大的困难，而且雌雄对于环境、营养条件的要求和反 应也不同，运也对鸟类性别鉴定提出了新的要求。同时，鸟类性别的早期鉴定和控制对于鸟 类配对、育种和遗传疾病的防治具有重要的意义，对由于环境污染、植被破坏及非法捕猎等 种种原因正逐步溯临灭绝的珍稀鸟类尤有意义，因此必须安全准确地鉴定出鸟类性别。
[0003] 性别决定是一个多基因级联调控的复杂过程，性别决定机制、性别控制和性别早 期鉴定研究一直是人们很感兴趣的课题，而鸟类性别决定的研究由于鸟禽养殖业的经济价 值而格外受到重视。自本世纪W来，对鸟类性别决定机制的研究已从形态学水平提高到分 子水平。近年来，在鸟类的Z染色体和W染色体上都克隆到了与性别决定相关的基因（雄鸟的 染色体是ZZ型，雌鸟的染色体是ZW型），性别鉴定的方法也随着性别决定机制研究的深入得 到同步发展，从个体水平、细胞水平发展到分子水平。现代分子新技术的进步，尤其是针对 性染色体特异基因序列的聚合酶链式反应(PCR)方法的使用提供了对鸟类实施安全、快速、 准确、高效性别鉴定的新方法。
[0004] 近年来开发的环介导等溫扩增（loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别祀序列上特异区域的引物和具有 链置换特性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等溫条件下高效扩增祀基因，灵敏度和 特异性高，该方法已广泛应用于病毒、类病毒、细菌及真菌的检测，而迄今尚未应用该技术 鉴定鸟类性别的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决技术问题是如何鉴定鸟类性别。
[0006] 本发明首先提供了一种成套引物，由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和 引物B3组成。
[0007] 所述引物FIP为如下(al)或(曰2):
[000引（al)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0009] (a2)将序列1经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有 相同功能的DNA分子。
[0010] 所述引物BIP为如下(bl)或化2):
[0011] (bl)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0012] (b2)将序列2经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有 相同功能的DNA分子。
[0013] 所述引物LF为如下（cl)或(c2):
[0014] (cl)序列表的序列3所示的单链DM分子；
[0015] (c2)将序列3经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有 相同功能的DNA分子。
[0016] 所述引物LB为如下(dl)或(d2):
[0017] (dl)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
[0018] (d2)将序列4经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有 相同功能的DNA分子。
[0019] 所述引物F3为如下(el)或(e2):
[0020] (el)序列表的序列5所示的单链DM分子；
[0021] (e2)将序列5经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有 相同功能的DNA分子。
[0022] 所述引物B3为如下(fl)或(f2):
[0023] (fl)序列表的序列6所示的单链DM分子；
[0024] (f2)将序列6经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有 相同功能的DNA分子。
[0025] 序列表的序列1由45个核巧酸组成，序列表的序列2由44个核巧酸组成，序列表的 序列3由25个核巧酸组成，序列表的序列4由25个核巧酸组成，序列表的序列5由23个核巧酸 组成，序列表的序列6由21个核巧酸组成。所述成套引物可W对雌鸟的基因组DNA进行特异 性的环介导等溫扩增。
[0026] 所述成套引物中，所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF、所述引物LB、所述引物 F3和所述引物B3的摩尔比可为8:8:4:4:1:1。
[0027] 所述成套引物中，各引物的量如下：1.6μπιο1所述引物FIP、1.6ymol所述引物BIP、 0.祉mol所述引物LF、0.祉mol所述引物LB、0.2皿〇1所述引物F3、0.2皿〇1所述引物B3。
[0028] 所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。
[0029] 所述成套引物的用途为a)或b):a)制备用于鉴定鸟类性别的试剂盒;b)鉴定鸟类 性别。
[0030] 所述成套引物在制备用于鉴定鸟类性别的试剂盒或鉴定鸟类性别中的应用也属 于本发明的保护范围。
[0031 ]所述鸟类可为白冠长尾锥。
[0032] 本发明还保护含有所述成套引物的试剂盒;所述试剂盒的用途为鉴定鸟类性别。
[0033] 所述试剂盒还可包括Bst DNA聚合酶和/或甜菜碱。
[0034] 所述试剂盒还可包括巧光显色剂。
[0035] 所述巧光显色剂具体可为巧黄绿素巧光染料。
[0036] 所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0037] 所述试剂盒的制备方法可为如下（Ι)、（Π )或（虹）：
[0038] (I)所述成套引物中各条引物分别单独包装；
[0039] (Π)所述成套引物中各条引物按照所述摩尔比混合在一起；
[0040] (虹)所述成套引物中各条引物按照所述量混合在一起。
[0041] 所述试剂盒在鉴定鸟类性别中应用也属于本发明的保护范围。
[0042] 所述鸟类可为白冠长尾锥。
[0043] 本发明还保护一种鉴定待测鸟类性别的方法，包括如下步骤：
[0044] 提取待测鸟类的基因组DNA，W所述成套引物进行环介导等溫扩增，然后进行如下 评判:如果所述成套引物可W实现对所述基因组DNA的环介导等溫扩增，则所述待测鸟类为 或候选为雌性;如果所述成套引物不能实现对所述基因组DNA的环介导等溫扩增，则所述待 测鸟为或候选为雄性。
[0045] 所述"鉴定待测鸟类性别的方法"具体可为方法一，包括如下步骤:提取待测鸟类 的基因组DNA，W所述成套引物进行环介导等溫扩增，如果浊度曲线呈现为典型的"S型"、则 所述待测鸟类为或候选为雌性，如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测鸟为或候选为 雄性。
[0046] 所述"鉴定待测鸟类性别的方法"具体可为方法二，包括如下步骤:提取待测鸟类 的基因组DNA，W所述成套引物进行环介导等溫扩增(反应体系中含有巧黄绿素巧光染料）， 得到待测样本反应液，目测待测样本反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则所 述待测鸟类为或候选为雌性，如果待测样本反应液为澄色、则所述待测鸟为或候选为雄性。
[0047] 所述巧黄绿素巧光染料可为向31.12mg巧黄绿素（sigma公司产品，产品目录号为 B2346)和197.9mg氯化儘（sigma公司产品，产品目录号为G5468)中加入lOmL超纯水得到的 染料。
[004引所述环介导等溫扩增可在60~67°C条件下进行。
[0049] 所述环介导等溫扩增具体可在64°C条件下进行。
[0050] 所述鸟类可为白冠长尾锥。
[0051] 实验证明，本发明提供的一种鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒及其专用引物能准确鉴 定鸟类性别。本发明提供的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒及其专用引物对鸟类的基因组DNA 的最小检测限为528pg，比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍，且具有耗时短和操作简单的 优点，具有重大的应用价值。
【附图说明】
[0052] 图1为鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的最佳溫度的筛选。
[005引图2为鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的特异性。
[0054] 图3为鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的灵敏度。
[0055] 图4为鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的灵敏度。