用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法

用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于控制昆虫侵袭的核巧酸序列及其方法，特别是设及一种利用 RNAi技术降低或关闭盲睹峻体内祀标序列的表达来控制盲睹峻的方法。
【背景技术】
[0002] 农田作物通常是昆虫攻击的目标。在过去数十年中，关于开发用于作物中昆虫侵 袭的更为有效的方法和组合物，已有了一些实质性的进展。化学杀虫剂对于控制有害生物 侵袭是比较有效的手段。但是，使用化学杀虫剂同时也有很多缺点。首先化学杀虫剂是非选 择性的，人们意欲应用化学杀虫剂来控制对多种作物和其他植物来说有害的昆虫，但是由 于其缺乏选择性，化学杀虫剂对于非目标的生物也会造成伤害，例如版蝴等。并且，在化学 杀虫剂应用过的一段时间，通常会使田野贫瘡。化学杀虫剂持续存在于环境中，通常很慢被 代谢。运种缓慢代谢，使得作物及环境中存在化学杀虫剂的残留，它们会积累于食物链中， 特别是高等食肉动物的食物链中。运些化学杀虫剂的积累导致对更高端的物种诱导了疾 病，例如人类的癌症。因此人们强烈需要对环境友善的方法用于控制或根除作物生产中的 昆虫侵袭，即选择性的，环境友好的，生物可降解的，并且能很好地用于有害生物抗性管理 体系的方法。
[0003] 在过去的几十年中，开发用于控制植物虫害的有效方法已取得了实质性的进展。 化学杀虫剂虽然对于根除植物害虫非常有效，但是其对于非祀标昆虫也会施加作用，同时 化学杀虫剂持续存在于环境中，不仅对环境造成不可逆的污染，还会导致抗药性昆虫的出 现。微生物杀虫剂，特别是从苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis，简称化)菌株所获 得的杀虫剂，作为化学杀虫剂的替代品，在农业生产中发挥了重要作用，其对包括鱗翅目、 双翅目、銷翅目和半翅目等昆虫具有一定的杀虫活性，但是微生物杀虫剂对于施药环境的 要求比较高，如果环境不适合运些微生物的生长，在生产上则需要重复施用，有些甚至重复 施用也不能达到控制害虫的目的，大大增加了生产成本。通过基因工程将编码化杀虫蛋白 的一种或多种基因转入植物中，可获得一些害虫抗性增强的转基因植物，例如经基因工程 产生C巧毒素的玉米和棉花植物已经广泛应用于美国的农业生产中，并且为农民提供了传 统害虫控制方法的可选方案。但是目前开发的含有Cry毒素的转基因作物只能用于防治范 围相对狭窄的害虫，而尚未有能够防治刺吸式害虫的产品。而刺吸式害虫因其繁殖速度快， 分布区域广，正在成为已开发的转基因作物中的最主要害虫。
[0004] 本领域中已报道了反义方法和组合物，它们被相信能通过单链RNA分子(理论上， 能在体内与高度互补的正义链RNA分子杂交)的合成施加其作用。反义技术难于在很多系统 中使用，运有Ξ个主要原因。首先，转化细胞中表达的反义序列不稳定。第二，转化细胞中表 达的反义序列的不稳定性随之对将该序列运送到远离转基因细胞的宿主、细胞类型或生物 系统造成困难。第Ξ，随着不稳定性和反义序列的运送遇到的困难对于如下企图来说也制 造困难，所述企图是:在编码该反义序列的重组细胞内部提供能有效调节目标正义核巧酸 序列表达水平的剂量。
[0005] RNA干扰或RNAi是用W在细胞或整个生物体环境下W序列特异性方式下调基因表 达的一种方法，其通过特异性祀向选择和高效mRNA遏制，可W达到定向干设祀基因表达的 目的。虽然利用RNAi技术来进行害虫防治是本领域的已知的，但是将运种技术用作控制昆 虫侵袭措施的关键因素是选择最适当的祀基因，即功能缺失导致必需生物过程严重破坏 和/或生物体死亡的那些基因。因此，本发明将下调害虫中的特定祀基因作为一种手段来实 现控制昆虫侵袭，特别是控制植物的昆虫侵袭。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种用于控制昆虫侵袭的核巧酸序列及其方法，即利用RNAi 技术按下述方式来下调祀标序列的表达:削弱昆虫存活、生长、繁殖、定殖特定环境和/或侵 袭寄主的能力，W实现控制昆虫侵袭及由其造成的损害。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种分离的多核巧酸序列，包括：
[000引（a)SEQ ID N0:l、2或3所示的多核巧酸序列;或
[0009] (b)在严格条件下与(a)限定的多核巧酸序列杂交的多核巧酸序列;或
[0010] (C)与(a)限定的多核巧酸序列具有80% W上同一性的多核巧酸序列;或
[0011] (d)(a)限定的多核巧酸序列的至少17个连续核巧酸的多核巧酸序列，其中半翅目 昆虫害虫摄取包含与所述多核巧酸序列互补的至少一条链的双链RNA，抑制所述半翅目昆 虫害虫的生长;或
[0012] (e)上述(a)、（b)、（c)或(d)限定的多核巧酸序列的互补序列。
[0013] 进一步地，所述多核巧酸序列还包括所述多核巧酸序列的互补序列。
[0014] 更进一步地，所述多核巧酸序列还包括间隔序列。
[0015] 优选地，所述多核巧酸序列为SEQ ID N0:4、5或6。
[0016] 为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控 下的所述多核巧酸序列。
[0017] 为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述多核巧酸序列或所述表达盒的重 组载体。
[0018] 为实现上述目的，本发明还提供了一种所述多核巧酸序列用于干扰半翅目昆虫害 虫祀标序列表达或抑制半翅目昆虫害虫生长的用途。
[0019] 为实现上述目的，本发明还提供了一种干扰核糖核酸序列，所述干扰核糖核酸序 列在被半翅目昆虫害虫摄入后起到下调所述半翅目昆虫害虫中至少一种祀标序列表达的 作用，其中所述干扰核糖核酸序列包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含退火 的互补链的一个双链RNA区域，其中一条链包含与所述祀标序列内的一个祀标片段至少部 分地互补的一个核巧酸序列或由其组成，所述祀标序列包含所述多核巧酸序列。
[0020] 进一步地，所述沉默元件包含与所述祀标序列内的一个祀标片段互补至少部分地 互补的一个至少19个连续核巧酸的序列或由其组成。
[0021] 可选择地，所述干扰核糖核酸序列包含至少两个沉默元件，每一个所述沉默元件 包含与所述祀标序列内的一个祀标片段至少部分地互补的一个核巧酸序列或由其组成。
[0022] 进一步地，所述沉默元件各自包含与一个不同的祀标片段互补的一个不同的核巧 酸序列或由其组成。
[0023] 更进一步地，所述不同的祀标片段来源于单一祀标序列或来源于不同的祀标序 列。
[0024] 所述不同的祀标序列来源于相同的半翅目昆虫害虫或不同的半翅目昆虫害虫。
[0025] 优选地，所述半翅目昆虫害虫为盲睹峻。
[0026] 在上述技术方案的基础上，所述干扰核糖核酸序列还包括间隔序列。
[0027] 具体地，所述干扰核糖核酸序列为SEQ ID NO:4、5或6。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制半翅目昆虫害虫侵袭的组合物，包含 至少一种所述干扰核糖核酸序列和至少一种合适的载体、赋形剂或稀释剂。
[0029] 进一步地，所述组合物包含一种表达或能够表达所述干扰核糖核酸序列的宿主细 胞。具体地，所述宿主细胞是细菌细胞。
[0030] 更进一步地，所述组合物是固体、液体或凝胶。具体地，所述组合物是杀虫喷雾剂。
[0031] 可选择地，所述组合物还包含至少一种杀虫剂，所述杀虫剂为化学杀虫剂、马铃馨 块茎特异蛋白、苏云金芽抱杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧抱芽 抱杆菌杀虫蛋白或球形芽抱杆菌杀虫蛋白。
[0032] 为实现上述目的，本发明还提供了一种所述控制半翅目昆虫害虫侵袭的组合物用 于预防和/或控制半翅目昆虫害虫侵袭的用途。
[0033] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制半翅目昆虫害虫侵袭的方法，包括使 半翅目昆虫害虫与有效量的至少一种所述干扰核糖核酸序列接触。
[0034] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制半翅目昆虫害虫的植物的方法， 包括将所述多核巧酸序列或所述表达盒或所述重组载体导入植物。
[0035] 为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由半翅目昆虫害虫引起 的损伤的方法，包括将所述多核巧酸序列或所述表达盒或所述重组载体导入植物，导入后 的植物在被半翅目昆虫害虫摄食后起到抑制所述半翅目昆虫害虫的生长的作用。
[0036] 在上述技术方案的基础上，所述植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜、 棉花或向日葵。所述半翅目昆虫害虫为盲睹峻。
[0037] 本发明包含对半翅目昆虫害虫中一种或多种祀标序列的表达加 W调节或抑制的 方法，所述方法包括:将经稳定的双链RNA(如dsRNA)或其修饰形式(例如，小干扰RNA序列） 的部分或全部引入到无脊椎有害昆虫体内细胞或细胞外环境中。在昆虫体内，dsRNA或 siRNA进入到细胞中，对至少一种或多种祀标序列的表达加 W抑制，并且运种抑制产生了减 弱昆虫存活、生长、繁殖W及侵袭寄主的能力。
[003引本发明提供了一组分离和纯化的多核巧酸序列，如SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:3所 示。本发明提供稳定化的双链RNA分子，用于抑制半翅目害虫中从运些序列和片段表达祀标 序列。稳定化的双链RNA包括至少两个编码序列，它们相对于至少一个启动子是有义和反义 方向排列的，其中包含有义链和反义链的核巧酸序列通过至少约5-1000个核巧酸的间隔序 列连接或相连，其中有义链和反义链可W是不同的长度，并且其中所述两个编码序列中的 至少一个编码序列与SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示的任何一个或多个核巧酸序列具有 至少80%的序列同一性，至少90%，至少95%，至少98%，或100%的序列同一性。
[0039]当表达为dsRNA并且提供给害虫时，该片段可W定义为导致害虫死亡、摄食抑制、 受阻或停止。该片段可W例如包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:3中任何一个或多个序列或其 互补序列的至少约19,21，23,25,40,60,80，100，125或更多个连续核巧酸，或约19-约100个 核巧酸，或更多。特别有用的是包括约19300个与害虫祀标序列同源的核巧酸的dsRNA序列。 本发明也提供了从任何所述多核巧酸序列表达的RNA，包括dsRNA。可W来自一种或多种祀 害虫的单个序列构建选择用于表达基因抑制剂的序列，并且用于表达抑制一种或多种祀害 虫中的单个基因或基因家族的RNA，或该DNA序列可从多种DNA序列构建为嵌合体。
[0040]本发明中所述的植物可W包括一种植物的任何生殖或繁殖材料，还可W包括植物 细胞、植物原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织及在植物或植物的部分中完好的植物 细胞，运些植物部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖 等。
[0041 ] 本发明所述的盲睹峻化ygus)属于半翅目巧eteroptera)盲睹科(Miridae)，是农 业生产上的一类重要害虫。目前我国常见的种类有绿盲睹Apolygus lucorunKMeyer-Diir)、 中黑盲睹 Adelphocoris sutural is (Jakovlev)三点盲睹 Adelphocoris fasciaticollis (Reuter)、首猜盲睹Adelphocoris lineolatus(Goeze)和牧草盲睹Lygus pratensis 化innaeus)等。W绿盲睹峻危害最严重，成虫W针刺吸附植株汁液为害，喜食植物的花、蕾、 果实等生殖器官。
[0042] 本发明中所述的"控制昆虫"或"控制害虫"或"控制昆虫害虫"是指能够导致昆虫 引起的损害受到限制且作用于昆虫的任何作用，包括但不限于杀死昆虫、抑制昆虫发育、W 昆虫对植物提供较小损害的方式改变昆虫的繁殖力或生长、减少昆虫产生的后代数量、产 生的正常昆虫更少、产生更易受捕食者攻击的昆虫或者阻止昆虫哨食植物。
[0043] 本发明中所述的"祀标序列"为意图在昆虫中下调的任何序列。通过下调祀标序列 来控制昆虫的侵扰，例如破坏昆虫中必需的生物过程。因此，优选的祀标序列包括但不限于 在调控摄食、存活、生长、发育、生殖、侵袭W及侵染方面发挥关键作用的基因。当该祀标序 列的表达被下调或受抑制时，至少20%的昆虫被杀死;或阻止/延缓/妨碍/延迟/阻碍了至 少20 %的昆虫的生长，阻止了至少20 %的昆虫生殖，阻止了至少20 %的昆虫通过生命周期 的转变;或由昆虫引起的损害和/或昆虫侵染或侵扰环境、表面和/或植物或作物物种的能 力降低;或至少20%的昆虫停止从其天然食物资源(如植物和植物产物）中摄食。运些祀标 序列可W在昆虫细胞的全部或部分中表达。此外，运些祀标序列可W仅在昆虫的生命周期 的特定阶段表达，例如成虫期或幼虫期或卵期。
[0044] 在本发明中，术语"害虫"优选地是引起植物侵袭/侵扰/侵染的昆虫，且属于半翅 目，优选为盲睹峻。术语"侵扰"、"侵染"和/或"侵袭"总体上通篇是可W互换使用的。
[0045] 本发明"RNA干扰(RNAi)"是指一些RNA可W高效、特异地阻断体内特定基因的表 达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或干设。RNA干 扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。
[0046] 本发明中"核酸"指从5'至3'末端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单或双 链聚合物。可选地，"核酸"还可含有非天然存在的或被改变的碱基，其允许通过聚合酶的正 确阅读，不会降低该核酸编码的多肤的表达。"核巧酸序列"指作为