>[0030] 实施例2 stdl突变体的矮化与GA关系
[0031] 为了进一步明确stdl突变体的矮化是否与赤霉素(GA))合成或信号转导途径有 关，用10 4M GA3处理水稻幼苗2周，处理前后分别测量野生型和突变体的第二叶銷长度。经 GA3处理后，野生型的第二叶銷长度显著增加，而突变体第二叶銷长度无显著变化，运说明 stdl突变体对GA信号不响应(图2)。目前已报道的GA信号转导方面的突变体，如极度矮化突 变体gidl和gid2,它们均具有较宽、暗绿色的叶片，而stdl突变体表型与其显著不同，该突 变体生长受抑制是不依赖于赤霉素的其他发育或细胞学的重要机制发生缺陷而引起的。
[0032] 实施例3水稻STD1基因的获得
[0033] 将杂合状态的stdl突变体与表型正常且多态性高的釉稻品种Dular杂交，F1收种 后次季播种观察突变性状分离情况。对F2代发生性状分离的株系分析表明，正常单株与突 变单株均符合3:1的分离比例，由此表明该突变性状受一对隐性基因控制。
[0034] WF2的58个突变体为材料，利用均匀分布于水稻12条染色体上的170个Indel标 记，将候选基因定位于第2染色体长臂上，与Inde 1标记C2-3和C2-4连锁（图3A)。为了精细定 位该基因，将定位群体扩大到337株F2代突变单株，并在C2-3和C2-4之间开发了新的InDel 标记C3-1、C3-2和C3-3，结果发现标记C3-2和C3-3分别只有3个和1个交换单株，表明候选基 因定位于C3-2和C3-3之间（图3A)。运两个标记之间的物理距离约为55肺，使用Rice Genome Annotation Project(水稻基因组注释系统）网站//rice.plantbiology.msu.edu/) 预测该定位区间内的基因，共得到7个开放读码框，其中一个阅读框0s02巧6540是编码类驱 动蛋白的基因。W往研究表明驱动蛋白是细胞内部运输系统的关键组分，对于细胞学功能 及形态建成是必须的，因此将0s02巧6540确定为候选基因。
[0035] 为了进一步明确候选基因，对野生型和突变体的开放阅读框0s02巧6540对应的基 因组序列进行了测序分析，发现stdl突变体中，该阅读框从ATG计数第119个碱基发生了由T 到A的碱基置换，密码子由GTG变为GAG，导致第40位氨基酸由鄉氨酸(Val)突变成谷氨酸 (Glu)(图3B)。因此确定0s02巧6540为候选基因 STD1。设计引物扩增获得了该基因的全长基 因组序列及CDS序列，发现该基因组由6个外显子5个内含子组成，全长4052bp，编码区长度 269化P，编码的类驱动蛋白由896个氨基酸组成。
[0036] 实施例帥设及的引物序列如表1所示。
[0037] 表 1 [00；3 引
[0039] 实施例4 STD1-GFP载体转化水稻
[0040] 为了进行功能互补实验和STD1蛋白的亚细胞定位分析，构建了植物表达载体。首 先用引物CGFP(表2)扩增绿色巧光蛋白基因，并将其插入具有潮霉素抗性的双元表达载体 pCAMBIA1305.1的Κρη巧日化11之间。然后用表2中的STD1 (C)引物，W野生型基因组为模板扩 增长度为684269的序列，该序列包括279369的启动子序列（如56〇10^).3所示序列）和 0s02巧6540编码部分的基因组序列（如沈Q ID NO.4所示序列），且不含0s02巧6540基因组 序列的终止密码子。将运段序列插入之前已连接入GFP序列的PCAMBIA1305.1载体，酶切位 点为EcoRI和ΚρηΙ。构建好的载体如图4所示，用电击法转入农杆菌EHA105。水稻stdl/STDl 杂合体结的种子诱导愈伤，鉴定为纯合体种子诱导获得的愈伤作为受体材料，用农杆菌介 导的转化方法进行水稻的转化。经过转化获得了九个独立转化的株系。如图5A、5B和5C所 示，几乎所有株系均表达STD1融合的绿色巧光蛋白，同时运些株系株高恢复正常，转基因株 系与野生型个体表型一致。运说明stdl突变体的表型是由0s02巧6540的突变导致的，确定 是STD1基因序列。
[0041] 表 2
[0042]
[0043] 实施例5水稻STDl基因表达模式
[0044] 采用半定量RT-PCR的方法分析了 STD1在种子、根、叶枕、叶片、幼穗、茎、结节、叶銷 及颖壳等组织中的表达情况，结果如图7A所示，尽管STD1在所有组织中均有表达，但在各个 组织中的表达水平不尽相同，其中在发育中的种子、幼穗W及茎中表达水平最高，其次是叶 銷和颖壳，在结节、叶枕、叶片和根中表达量最低。利用Real-time PCR的方法进一步分析了 STD1的组织表达模式，其结果与半定量RT-PCR方法检测的结果是一致的，STD1仍然在发育 的种子、茎和幼穗中表达量较高（图7B)。运种表达模式与该基因的功能作用是一致的，当 STD1突变后会导致植株严重矮化及不结实。
[0045] 为了更直观和准确的研究STD1在各个组织中的表达情况，克隆STD1起始密码子 ATG上游2.7肺的序列，并将其融合在GUS基因上游，构成STD1 promoter-GUS载体，如图6所 示，用其转化梗稻品种日本晴，并对转基因植株各发育时期进行GUS染色分析。结果如图7C 所示，STD1主要在分裂及生长活跃的部位表达。种子萌发时，STD1在新生的胚芽銷中表达量 较高，随着发育的进行，表达逐渐变弱（图7C-1，7C-2)。同时STD1在种子根和冠状根分裂旺 盛的根尖表达较高，至伸长区和成熟区表达逐渐减弱（图7C-2)。在茎的伸长阶段，STD1在节 间的下半部和结节处表达量较高，运些部位也是生长和分裂旺盛的区域（图7C-3,7C-4)。 STD1在叶片的表达量要低于叶銷（图7C-5,7C-6)。生殖生长阶段，小穗和花药中STD1均有表 达（图7C-7,7C-8)，说明STD1可能参与了幼穗的发育，此阶段的根部STD1表达量较低（图7C- 9)，但在根顶端分生组织、茎顶端分生组织及冠状根原基处5了01表达量较高（图7(：-10,7(：- 11，7C-12)。运些表达模式与stdl突变体的表型基本一致，表明STD1参与了细胞分裂的过 程。设及的引物序列如表3所示。
[0046] 表 3
[0047]
[004引实施例6 stdl突变体细胞分裂进程
[0049] stdl突变体生长速度变慢暗示细胞分裂进程可能出现异常，利用流式细胞仪分别 检测了野生型和突变体的根及叶片中DNA的倍性情况。各个细胞分裂相的统计结果显示，在 根及叶片中，stdl突变体中4C DNA的细胞比例均高于野生型，更多的细胞被阻滞在S期和 G2/M期（图84,88,8(：，80)，运说明3*(11突变体的极度矮化可能是由于细胞分裂变慢导致。
[0050] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 水稻极度矮化基因 STD1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2. 权利要求1所述基因 STD1所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. 含有权利要求1所述基因 STD1的表达载体。4. 含有权利要求3所述的表达载体的宿主。5. 根据权利要求4所述的宿主，其特征在于，所述宿主为水稻。6. 权利要求1所述的基因 STD1或权利要求3所述的表达载体在水稻株型改良中的应用。
【专利摘要】本发明提供了水稻STD1基因及其编码的蛋白，其基因序列如SEQ？ID？No.1所示，其蛋白序列如SEQ？ID？No.2所示。含有该基因的突变体主要表型为极度矮化，不能结实，只能以杂合体形式保存。另外，该突变体中更多的细胞被阻滞在S期和G2/M期，细胞形状和排列异常。STD1主要在分裂旺盛的组织表达。STD1基因通过调控细胞分裂直接控制水稻株高，有助于改善矮秆基因单一化的性状，并可作为新的矮化基因资源，应用于水稻株高的调控。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29, C07K14/415
【公开号】CN105543242
【申请号】CN201610060955
【发明人】李学勇, 房静静, 李晨晨, 赵琳琳, 赵金凤, 袁守江
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月28日