棘孢木霉acc脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种棘抱木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达 方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 内生菌是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细 菌。研究表明，内生菌的用途非常广泛，在农业生产方面，人们利用内生菌来增强其宿主的 抗逆性，抗虫害，促进植物的生长，增强宿主植物的环境适应能力，避免宿主受到迫害，运样 既减少了化学农药的大面积污染，又保证了农作物的天然性。在医学方面，从内生菌中寻找 更多抗癌和抗病的基因也成为现在的研究热点。在工业方面，内生菌产生的某些活性物质， 如具有抗性的特殊的酶类，在工业上也具有较大的应用潜力。
[0003] -般情况下，内生真菌与宿主是W互惠的方式进行共生，所W通常认为两者是互 利共生的关系。一方面，宿主植物为寄生的内生真菌提供生存环境和生长必须的养分;另一 方面，内生真菌会产生有利于宿主植物生长和发育的次级代谢产物，运些代谢产物在宿主 植物应对抗病虫害、抗旱和对病原体的括抗时发挥了重要作用。
[0004] 迄今为止已被发现的内生真菌包括接合菌、卵菌、担子菌、子囊菌、有丝分裂抱子 真菌和其无抱菌等多种菌群，其中曲霉属、镶抱霉属和拟茎点霉属为较优势的菌种。而从耐 盐植物种直接分离棘抱木霉还属于空白。
[0005] 植物在逆境下产生的大量逆境乙締阻碍其正常生长发育，严重时可导致植株死 亡。ACC脱氨酶可将植物乙締合成的直接前体ACC水解为α-酬下酸和氨，阻止植物内体乙締 的过量产生，有效促进逆境下植物的正常生长发育及延缓植物组织的衰老。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种棘抱木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、 构建方法及其蛋白表达方法，该毕赤酵母表达载体能够成功表达ACC脱氨酶，具有良好的耐 盐性。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种棘抱木霉ACC脱氨酶毕 赤酵母表达载体，将棘抱木霉的ACC脱氨酶基因和质粒PPIC9K连接后，转化毕赤酵母构建而 成。
[000引所述棘抱木霉为棘抱木霉(Trichoderma asperellunOKpS，保藏单位：中国典型培 养物保藏中屯、，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC N0:M 2015770,保藏日期： 2015年12月23日。
[0009] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种棘抱木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体 的构建方法，包括W下步骤：
[0010] (1)根据棘抱木霉菌株T203 ACC脱氨酶基因，设计特异性引物ACC，W棘抱木霉KpS 基因组DM为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收纯化，并连接Τ载体，转化大肠杆菌感 受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，得到大肠杆菌菌液，进行质粒抽提并测 序；
[0011] (2)根据步骤（1)的测序结果，设计特异性引物T-acdS，W步骤（1)大肠杆菌菌液为 模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物和载体质粒PPIC9K同时双酶切，两个酶切产物连接，连 接产物转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，质粒抽提并酶切 鉴定，酶切鉴定正确的命名为重组质粒pPIC9K-acds;
[0012] (3)用Sacl线性化重组质粒pPIC9K-acdS，然后电转化毕赤酵母感受态细胞即得。 [001引步骤(1)的特异性引物ACC为：
[0014] 正向引物ACC-FP:5'-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3'
[0015] 反向引物ACC-RP: 5 ' -GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3 '。
[0016] 步骤(2)的特异性引物T-acdS为：
[0017] 正向引物T-acdS-FP: 5 ' -TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3 '
[001 引 反向引物T-acdS-RP: 5 ' -GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3 '。
[0019]步骤（1)的PCR反应体系为：2XEs Taq MasterMix 12.5μ1，基因组DNA 0.扣1、10μ Μ正向引物0.扣1，ΙΟμΜ反向引物0.化1，补水到2扣1;步骤（1)的PCR反应条件为:94°C预变性 4min; 94°C 变性 30s，53°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 个循环;72°C 延伸 8min。
[0020] 步骤(2)的PCR反应体系为：2XEs Taq MasterMix 12.扣1，大肠杆菌菌液化1、10μ Μ正向引物0.扣1，ΙΟμΜ反向引物0.化1，补水到2扣1;步骤(2)的PCR反应条件为:94°C预变性 8min; 94°C 变性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，38 个循环;72°C 延伸 8min。
[0021] 步骤(2)的双酶切体系为：10 X Quick Cut Buffer扣1、载体质粒pPIC9K或PCR产 物化g，抓/μ1的SnaBI和Notl各化1，补水到50μ1;双酶切条件为:37°C金属浴消化化。
[0022] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种棘抱木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体 的蛋白表达方法，具体步骤为:将棘抱木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体接种到BMGY液体培 养基中，振荡培养至OD600为2-6，离屯、，弃上清，加 BMMY液体培养基重悬，并加入100%甲醇诱 导表达即得。
[0023] 本发明有益效果
[0024] 1、本发明首次从盐生植物海滨锦葵块根中分离出棘抱木霉，该棘抱木霉的ACC脱 氨酶活性较高，能够通过降解乙締合成前体，从而减少植物合成乙締，间接提高生长素和乙 締的比例，促进植物的生长。
[0025] 2、本发明从海滨锦葵块根中分离内生真菌，并将分离纯化的内生真菌接种在ADF 平板上，筛选得到10种海滨锦葵内生真菌，通过高通量比色法和2,4-二硝基苯阱比色法，最 终筛选得到菌株KpS，结合显微镜观察菌落、抱子观察及测序结果，确认菌株KpS为棘抱木霉 (Trichoderma asperellum)。实验表明，本发明最终筛选的棘抱木霉KpS在ADF平板上的ACC 脱氨酶活性可达4557.9化Μ地Bmg-ih-i，高于其它几种海滨锦葵块根内生真菌，甚至是其中 绝大多数内生真菌的几倍甚至是十几倍。
[0026] 3、本发明的棘抱木霉KpS接种海滨锦葵根系后，能够增强海滨锦葵的耐盐性，在高 盐条件下，显著提高海滨锦葵叶绿素含量，使海滨锦葵的叶片生长加快，叶片增厚，能够减 少水分蒸腾，提高幼苗的含水量，增加了海滨锦葵幼苗的干重和鲜重。
[0027] 4、本发明克隆了棘抱木霉KpS的acdS基因，构建含有acdS基因的重组质粒，并电转 化毕赤酵母，最终在甲醇的诱导下利用毕赤酵母成功表达了 ACC脱氨酶，为利用酵母作为生 物反应器工业化生产ACC脱氨酶提供了技术支持。该技术通过生产ACC脱氨酶，利用ACC脱氨 酶增强植物的耐盐性。
[0028] 5、本发明方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明原 料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。
【附图说明】
[0029] W下结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0030] 图1为海滨锦葵块根内生菌的ACC脱氨酶活性检测结果。
[0031] 图2为菌株KpS的菌落形态图。
[0032] 图3为菌株KpS的抱子形态图。
[0033] 图4为菌株KpS的PCR扩增产物电泳图，图中，Μ为Markera为PCR扩增产物。
[0034] 图5为棘抱木霉KpS对大豆幼苗生长影响的分析图。
[0035] 图6为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗鲜重影响的分析图。
[0036] 图7为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗干重影响的分析图。
[0037] 图8为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗含水量影响的分析图，图中，EF 为对照组，EI为菌处理组。
[0038] 图9为不同盐浓度下棘抱木霉KpS对海滨锦葵幼苗叶绿色含量影响的分析图，图 中，EF为对照组，EI为菌处理组。
[0039] 图10为棘抱木霉KpS的acdS基因的PCR扩增产物电泳图，图中，Μ为Marker, 1-3为 PCR扩增产物。
[0040] 图11为目的基因 acdS、载体质粒PPIC9K和重组质粒pPIC9K-acdS的电泳图，图中，Μ 为Markera为载体质粒pPIC9K，2为重组质粒pPIC9K-acdS的双酶切，3为线性化的重组质粒 pPIC9K-acdS，4为目的基因 acdS。
[0041 ] 图12为毕赤酵母转化子诱导表达产物电泳图，图中，Μ为Marker, 1、2、3、4、5分别为 毕赤酵母转化子在甲醇诱导12h、24h、4她、72h、96h的ACC脱氨酶表达量。
[0042] 图13为毕赤酵母转化子在化C1浓度0%、3%、6%、9%和12%的YPD平板上的生长 情况，图中，a、b、c、d、e分别为化C1浓度0%、3%、6%、9%和12%的YPD平板，其中，A为转化 子A69，B为转化子B11，C为转化子B35，D为转化子B43，CK为未经转化的的毕赤酵母（阴性对 照)。
[0043] 图14为毕赤酵母转化子在化C1浓度0%、3%、6%、9%和12%的液体培养基中的生 长情况。
【具体实施方式】
[0044] W下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0045] PDA平板:马铃馨洗净去皮，再称取200g马铃馨切成小块，加水煮烂，过滤，滤液加 20g琼脂，继续加热揽拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，揽拌均匀，再补足水分至 1000mL，12rC高压灭菌20min，铺平板，冷却即可。
[0046] DF无氮培养基（IL)Jg葡萄糖，地巧樣酸，4ml 50%葡萄糖酸溶液，0.2g MgS化· 7出0，0.1ml微量元素母液，0.1ml Mo〇3母液，0. lmlFeS〇4 · 7此0母液，定容至900ml超纯水， pH值调至7.2，121°C灭菌15min后，待冷却，加入100ml已灭菌的10 X憐酸盐母液。其中，
[0047] 微量元素母液（100ml):10mg 曲B〇3、