一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及组织工程技术领域，尤其设及一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法。
【背景技术】
[0002] 冻干粉中含有生物活性因子，当需要对冻干粉中生物活性因子的活性进行检测 时，可W将冻干粉添加入培养基中配制样品培养基，并与未添加冻干粉的对照培养基作为 基准，对成纤维细胞进行培养相同的时间，从而对对照品和样品作用下的成纤维细胞的增 殖量进行检测，可W获得样品相对于对照品的促细胞增殖率，从而能够对冻干粉中生物活 性因子的生物活性进行间接表征。
[0003] 由于冻干粉在冷冻干燥过程中需要添加冻干保护剂，因此，在将冻干粉添加入培 养基中得到样品培养基后，与对照培养基相比，渗透压大大增高，无法对冻干粉的促细胞增 殖率进行准确检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的在于，提供一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法。能够对冻干 粉的促细胞增殖率进行准确检测。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明实施例提供一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法，包括：
[0007] 步骤1)将待检测冻干粉溶解于完全培养基中获得样品培养基，其中，所获得的样 品培养基具有第一渗透压；
[000引步骤2)将未添加待检测冻干粉的完全培养基作为对照培养基，并调节所述对照培 养基的渗透压等于第一渗透压；
[0009] 步骤3)用所获得的样品培养基和对照培养基分别对相同数量的细胞在相同的条 件下进行培养，经过第一预设时间后获得样品作用下细胞和对照品作用下细胞；
[0010] 步骤4)对所获得的样品作用下细胞和对照品作用下的细胞进行Μ?Τ染色和吸光值 检测，通过对比二者的吸光值，获得样品相对于对照品的促细胞增殖率。
[00川优选的，所述完全培养基中血清的含量为10%-20%。
[0012] 可选的，所述待检测冻干粉至少包含：人表皮生长因子hEGF、血管内皮生长因子 VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-f31TGF-f31、转化生长因子-f32TGF-f32、类膜岛 素一号增长因子IGF-1、类膜岛素二号增长因子IGF-2、海藻糖、右旋糖酢40和甘露醇。
[0013] 优选的，所述步骤2)中调节所述对照培养基的渗透压等于第一渗透压之前还包 括:获取所述对照培养基的渗透压Y与渗透压调节剂在完全培养基中的添加量X的函数关 系。
[0014] 可选的，所述步骤2)中所述调节所述对照培养基的渗透压等于第一渗透压包括： 根据函数关系和所述第一渗透压Y1，计算所述渗透压调节剂的添加量XI，并将所获得的添 加量为XI的渗透压调节剂溶解于所述对照培养基中。
[0015] 优选的，所述渗透压调节剂为甘露醇，所述对照培养基的渗透压Υ与甘露醇在完全 培养基中的添加量X满足函数关系:γ = 5425.9Χ+336.87。
[0016] 可选的，所述细胞为小鼠成纤维细胞；
[0017] 所述小鼠成纤维细胞通过如下步骤获得：
[0018] 将小鼠成纤维细胞传代培养至生长对数期，用完全培养基悬浮并稀释至1-10 X 104个/ml，制备成细胞悬液，其中，所述完全培养基中的血清含量为10 %-20 % ;
[0019] 将所述细胞悬液W相同的密度接种于96孔板的不同孔中；
[0020] 将所述96孔板在预设培养条件下培养第二预设时间至细胞贴壁，获得小鼠成纤维 细胞。
[0021] 优选的，所述步骤3)中用所述样品培养基和所述对照培养基分别对相同数量的成 纤维细胞在相同的条件下进行培养包括:吸去所获得的小鼠成纤维细胞所在的96孔板内的 上清液，将所述样品培养基加入所述96孔板的至少2个孔中，将所述对照培养基加入所述96 孔板的其他至少2个孔中，对所述孔板内的小鼠成纤维细胞进行培养。
[0022] 可选的，所述步骤4)中对所获得的样品作用下细胞和对照品中的细胞进行MTT染 色和吸光值检测包括：
[0023] 吸去所述96孔板中的各个孔内的上清液，将MTT加入所述各个孔内对样品作用下 细胞和对照品作用下细胞进行染色；
[0024] 吸去经过染色后的各个孔内的上清液，将二甲亚讽加入各个孔内，并置于酶标仪 中震荡第Ξ预设时间，在测试波长下读取各个样品作用下细胞吸光值和对照品作用下细胞 吸光值。
[0025] 优选的，所述通过对比二者的吸光值，获得样品相对于对照品的促细胞增殖率包 括:将所获得的各个样品作用下细胞吸光值和对照品作用下细胞吸光值分别求平均值获得 第一吸光值和第二吸光值，将第一吸光值和第二吸光值代入公式促细胞增殖率=(第一吸 光值-第二吸光值)/第二吸光值X100%中计算获得。
[0026] 本发明实施例提供一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法。通过将添加有待检测冻 干粉的培养基作为样品培养基，将未添加待检测冻干粉的培养基作为对照培养基，并调节 所述对照培养基的渗透压与所述样品培养基的渗透压相等，并且，在相同的条件下对相同 数量的细胞进行培养，使得样品作用下细胞和对照品作用下细胞的生长环境相同，从而能 够对冻干粉促细胞增殖率进行准确检测。克服了现有技术中无法对冻干粉的促细胞增殖率 进行准确检测的缺陷。
【附图说明】
[0027] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述 中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些 实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附 图获得其它的附图。
[0028] 图1为本发明实施例提供的一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法的流程图；
[0029] 图2为本发明实施例提供的一种对照培养基的渗透压Y与甘露醇在完全培养基中 的添加量X的标准曲线。
【具体实施方式】
[0030] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每 一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可W对 本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部 分而说明或描述的特征可W用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031] 本发明实施例所设及的材料均可W通过商业途径或通过申请人获取。
[0032] 本发明实施例提供一种冻干粉促细胞增殖率的检测方法，参见图1，包括：
[0033] 步骤1)将待检测冻干粉溶解于完全培养基中获得样品培养基，其中，所获得的样 品培养基具有第一渗透压；
[0034] 步骤2)将未添加待检测冻干粉的完全培养基作为对照培养基，并调节所述对照培 养基的渗透压等于第一渗透压；
[0035] 步骤3)用所获得的样品培养基和对照培养基分别对相同数量的细胞在相同的条 件下进行培养，经过第一预设时间后获得样品作用下细胞和对照品作用下细胞；
[0036] 步骤4)对所获得的样品作用下细胞和对照品作用下细胞进行Μ?Τ染色和吸光值检 测，通过对比二者的吸光值，获得样品相对于对照品的促细胞增殖率。
[0037] 其中，MTT(3-(4,5-二甲基嚷挫-2)-2,5-二苯基四氮挫漠盐，商品名为嚷挫蓝)染 色又称MTT比色法，是用来检测细胞存活和生长的方法;具体原理为：活细胞线粒体中的班 巧酸脱氨酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲琐并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能;通过二甲基亚讽(DMS0)溶解细胞中的甲琐，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测 定其光吸收值，即可间接反映活细胞数量。在一定的细胞数范围内，光吸收值与活细胞的数 量呈正比。
[0038] 在本发明实施例中，通过MTT法可W间接反映样品和对照品中的活细胞数量，并 且，通过所获得的样品吸光值和对照品吸光值可W计算出样品相对于