miR-30c-5p在制备药物性肝损伤生物标志物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是设及一种微小RNA(microRNA)在制备药物性肝 损伤生物标志物中的用途。
【背景技术】
[0002] 由于药物及其代谢产物的毒性作用或机体对药物产生过敏反应从而对肝脏造成 损伤，即为药物性肝损伤化rug-induced 1 iver in jury，DILI)。据世界卫生组织统计，药物 性肝损伤已上升至全球死亡原因的第5位。近年来随着中草药广泛被全世界所认识，由中草 药诱导肝损伤的报道日益增多，引起了全世界的广泛关注。
[0003] 黄药子为馨葫科植物黄独(Dioscorea bu化ifera L.)的块茎，为临床常用中药。 其药用历史悠久，历代本草均有记载，具有散结消瘦、清热解毒、凉血降火之功效。黄药子在 临床上主要用于治疗甲状腺肿、胃癌、甲状腺瘤、肺癌、乳腺癌、子宫肌瘤、恶性淋己瘤等多 种癌症，具有良好的抗肿瘤活性。然而近年来发现黄药子存在明显的药物不良反应，对肝、 肾等都有一定的损害，尤其是肝损伤报道较多，从而大大限制了其在临床上的应用。黄药子 的主要有效成分为其所含的二祗内醋类和酱体皂巧类化合物，现代毒理研究证明，黄药子 的二祗内醋类成分黄药子甲素、乙素、丙素，为主要肝毒性成分，其中二祗内醋类成分黄独 素邮P黄独素乙素已被发现是其所含的主要肝毒性成分。
[0004] 生物标志物(Biomarker)是指可W标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功 能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊 断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。尽管与肝 脏毒性相关的传统生物标志物，如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)等 已经应用近50年之久，但是由于其在灵敏度和特异性方面存诸多局限，已无法满足当前对 药物诱导肝毒性的评价要求。因此，寻找和验证新的高灵敏度和高特异性的肝毒性生物标 志物已成为国内外高度关注的热点问题，也是药物性肝损伤研究领域亟待解决的难点之 〇
[000引 miRNA(microRNA)是一类新发现的非编码单链小分子RNA，约22个核巧酸长度，通 过识别特定的目标mRNA，与勒ImRNA的3'非翻译区（3' -unhanslated region，3' -UTR)互补 配对，进行蛋白翻译抑制或降解mRNA"miRNA广泛参与机体的生长发育、细胞的代谢、增殖、 分化和调亡，参与了肝损伤、肿瘤形成、屯、血管疾病等多种病理过程。因此，正常机体内 miRNA的变化也指示着机体正常生理功能的改变，乃至病变的发生。已有700多种miRNA被发 现，收载于miRBase数据库，目前miRNA已成为生命科学界研究的热点。已有研究人员对肿 瘤、屯、脑血管疾病等多种病症进行了 WmiRNA为诊断指标和治疗祀点为目的的研究，并取得 了一些进展。由于血浆、组织等生物样本中的miRNA在室溫、高溫、不同pH、多次冻融后仍能 检测到，并且含量变化不大，而此时大多数RNA、蛋白质、酶都会降解、失活，因此miRNA的稳 定性;快速、高通量的miRNA忍片检测技术;miRBase数据库的日益完善，为其作为肝毒性生 物标志物进行检测提供了可能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的旨在提供一种微小RNA在制备药物性肝损伤生物标志物中的用途。
[0007] 如本发明所用，小鼠的miR-30c-5p是一段成熟的微小RNA(miRNA，microRNA)序列， 其碱基序列为:UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(沈Q ID No. 1)。
[0008] 具体地说，本发明的第一方面是提供了 miR-30c-5p在制备检测黄药子导致的肝损 伤的生物标志物中的应用，所述miR-30c-5p的碱基序列如SEQ ID No.l所示。
[0009] 在一优选例中，所述黄药子的用量不会引起血清ALT或AST活性的增强。
[0010] 本发明的第二方面是提供了 miR-30c-5p在制备检测黄独素 B导致的肝损伤的生物 标志物中的应用，所述miR-30c-5p的碱基序列如SEQ ID No.l所示。
[0011] 本发明的第Ξ方面是提供了 miR-30c-5p在制备排除对乙酷氨基酪导致的肝损伤 的生物标志物中的应用，所述miR-30c-5p的碱基序列如SEQ ID No.l所示。
[0012] 本发明还提供了 miR-30c-5p在制备排除野百合碱导致的肝损伤的生物标志物中 的应用，所述miR-30c-5p的碱基序列如沈Q ID No.l所示。
[0013] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得W详尽描述。通过下文W及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【附图说明】
[0014] 图1不同剂量的黄药子乙酸乙醋提取物巧F)对各组动物血清ALT、AST水平的影响。 (T ±SE)，与正常组比较，冲<〇.〇5。
[001引图2黄独素 B(DB) (350mg/kg)对各组动物血清ALT、AST水平的影响。（Γ ±化)，与正 常组比较，林冲<0.001。
[0016] 图3 APAP(350mg/kg)对各组动物血清ALT、AST水平的影响。（Γ ±SE)，与正常组比 较，林冲<0.001。
[0017]图4 MCT(360mg/kg)对各组动物血清ALT、AST水平的影响。（Γ ± SE)，与正常组比 较，林冲<0.001。
[0018] 图5不同剂量的黄药子乙酸乙醋提取物化F)和黄独素 B对各组动物血清miR-30c- 5p水平的影响。（Γ ±化)，与正常组比较，*冲<0.01，**冲<0.001。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所使用的试剂和原料均可通过商业途径购买获 得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议 的条件。
[0020] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中 所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0021] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可W任意组合。本专利说明书所掲 示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所掲示的各个特征，可w任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所掲示的特征仅为均等或相似 特征的一般性例子。
[0022]实施例1黄药子乙酸乙醋提取物和黄独素 B诱导小鼠肝毒性 [002引 1.1实验材料
[0024] 1.1.1实验动物
[002引ICR小鼠，方，体重18~22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证 号：SCXK(沪）2012-0002。小鼠饲养溫度（22 ± 1)°C，相对湿度（65 ± 10) %，照明时间每天 12h。动物适应性喂养4天，自由取食、饮水。
[0026] 1.1.2受试药物及其制备
[0027] 黄药子乙酸乙醋提取物化F):称取黄药子粗粉4000g，加10倍体积80%乙醇回流提 取化，提取4次，合并提取液，再用等体积乙酸乙醋萃取8次，合并萃取液，转移至玻璃容器， 减压浓缩，即得黄药子乙酸乙醋提取物化巧。
[002引 1.1.3仪器酶标仪（公司：美国Bio-Tech,型号：SynergyH4)
[0029] 1.2实验方法
[0030] 1.2.1高效液相色谱测定EF中黄独素 B的含量
[0031 ]色谱柱为ultimate TM XB-C18column(4.6X250mm,5皿）；流动相条件为乙腊-水 =25 : 75 (v/v)，流速为1. OmL/min，等度洗脱；进样体积为10化;柱溫为25°C ;检测波长为 210皿。首先取黄独素 B(DB)适量，精密称定，加甲醇配成Img/ml的溶液，混匀，即得对照品溶 液。DB(1000yg/血）用甲醇稀释至一系列浓度：7.81，15.63,31.25,62.5，125,250yg/血，混 匀，用0.45μπι有机相滤膜滤过，取续滤液进样，按照上述液相条件运行，积分求得峰面积值， 结果W浓度(yg/mU对峰面积值进行回归分析获得标准曲线和相关系数。其次，取黄药子乙 酸乙醋提取物化F)适量，精密称定，置25ml容量瓶中，加70 %乙醇超声使之溶解，冷却后定 容至刻度，用0.45μπι有机相滤膜滤过。取制得的供试品溶液按照上述液相条件运行，所得的 峰面积值代入上述标准曲线，计算DB含量。
[0032] 1.2.2肝毒性动物实验
[0033] EF致肝毒性分析:动物随机分为空白对照组、EF(450mg/kg)给药组、EF(375mg/kg) 给药组、EF(300mg/kg)给药组。实验前动物禁食不禁水12h，除C0NT组（给予等体积生理盐 水)外，其余各组小鼠〇.2ml/10g灌胃给药各剂量EF，给药后2地处死动物，取血分析。
[0034] 黄独素 B(DB)致肝毒性分析:动物随机分为空白对照组、DB给药组。实验前动物禁 食不禁水12h，除C0NT组（给予等体积生理盐水）外，其余各组小鼠0.2ml/lOg灌胃给药DB (300mg/kg)