一种利用荧光检测微囊藻细胞dna损伤的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境检测与生态毒理评价技术领域，更具体涉及一种微囊藻细胞DNA损伤检测的方法，它适用于水体中有毒有害物质的生态安全评价及水环境中致癌致畸因子的早期监测预警。
【背景技术】
[0002]随着水体富营养化的加剧，蓝藻水华现象时常发生。蓝藻水华造成水质急剧恶化，鱼类大量死亡，生境退化。微囊藻作为水华的主要藻种之一，不仅增殖能力强，而且产生微囊藻毒素，导致家畜死亡，也可能引发人类肝脏癌变。DNA作为中心法则的核心，对细胞的分裂、代谢与调控起着决定性作用，DNA损伤作为一个灵敏而有代表性的生物标志物，广泛应用于生态毒理与安全评价中。针对不同控藻方法的微囊藻DNA损伤评估，不仅有助于蓝藻水华控制技术的开发；同时，微囊藻对环境中致癌致畸因子响应灵敏，通过对微囊藻DNA损伤的检测，可实现对水体环境中致癌致畸因子的早期监测预警。
[0003]目前还没有专门针对微囊藻细胞DNA损伤检测的方法。Singh等(“Asimpletechnique for quantitat1n of low levels of DNA damage in individual cells”.Singh et al.,Experimental Cell Research，卷:175期:I页:184-191，1988年3月15日)在前人方法的基础上，提出了单细胞凝胶电泳法测定细胞DNA损伤。该方法简便，灵敏，在医学和毒理学检测研究中有较多的应用。然而，该方法只能检测单链DNA损伤，并且操作主观性强，不同操作者实验结果偏差较大，因而限制了这一方法的广泛应用。最近，有一些学者提出了利用PCR扩增的方式来检测DNA链断裂的方法，如RAPD、rDNA和ARDRA(“Evidencesshowing ultrav1let-B radiat1n-1nduced damage of DNA in cyanobacteria andits detect1n by PCR assay，，.Kumar.，et al,B1chemical and B1physical ResearchCommunicat1ns，卷:318期:4页:1025-1030 ,2004年6月11日)，以及通过实时荧光定量PCR(“DNA supercoiling suppresses real-time PCR: a new approach to thequantificat1n of mitochondrial DNA damage and repair”.Chen et al.,NucleicAcids Research，卷:35期:4页:1377-1388，2007年2月11日)的办法来定量DNA损伤的程度，这些方法在特定细胞DNA链断裂检测中显示了很高的特异性，但应用藻类DNA损伤中还有待进一步实验证实，并且该方法操作难度大，需要大型仪器如荧光定量PCR仪，测试费用高，难以普遍应用于环境检测。本方法是根据不同断裂水平的DNA链在碱性溶液中解旋速率不同，通过荧光染色对解旋后DNA链中双链部分进行定量来测定细胞DNA损伤。其原理为:DNA链断裂后，自由末端增多，双链DNA在适宜的碱性pH值下氢键断裂，双链DNA解链，自由末端越多，解旋速率越快。双链DNA荧光染料Hoechst 33258能选择性的与双链DNA结合，而不与单链DNA结合，由此可以计算DNA单双链的比例，通过比较相同解旋时间后DNA单双链的比例，来计算DNA链断裂的水平。本方法不会受到染色体结构的影响，并且灵敏度高，可以检测到染色体上的单个断裂位点，因此非常适合测定浮游生物DNA链断裂。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是在于提供了一种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法，该方法的优点在于检测不需要大型仪器，对操作者分子生物学的专业知识要求不高，易于掌握，并且灵敏度高，DNA链上单个断裂位点即可检测到。
[0005]—种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法，其步骤是:
[0006](a)分组设定:除待检测样品外设置正常生长的样品为对照组，待检测样品标记为t，对照样品标记为0，将待检测样品和对照样品分别平均分成三组，测试样品标记为Pt样品、Tt样品和Bt样品；对照样品分别标记为Po样品、To样品和Bo样品。在以下步骤(b)至⑴中，对测试样品和对照样品处理方式相同，因此，在以下步骤(b)至(f)的表述中，T样品包含Tt样品和To样品，？样品包含Pt样品和Po样品，13样品包含Bt样品和Bo样品；
[0007](b)去除细胞角质鞘:1500乂8离心151^11收集1'、？和8样品中藻细胞，将细胞重悬浮于ImL SE缓冲液(SE缓冲液的配制方法:50mM NaCl,50mM Tris,5mM EDTA)，调pH至8.0颠倒混勾洗涤2?5m i η;
[0008](c)细胞裂解:1500\8离心151^11，去上清，将细胞分别重悬浮于415￥(￥代表1至100微升之间的任意体积，下同)体积的LyS i S裂解液(Lysi s裂解液的配制方法:40mM EDTA，400mM NaCl,50mM Tris-HCl，pH=9.0)，分别加入50V体积的浓度为50mg/ml溶菌酶，上下颠倒样品管三次，37°C反应20min;然后加入10￥体积浓度为511^/1111的蛋白酶K和25V体积浓度为10 %的十二烷基磺酸钠，上下颠倒样品管三次，50°C反应2h;
[0009](d)细胞DNA链解旋:T样品加入1000V体积的超纯水，混匀;B样品加入500V体积的
0.1M NaOH混匀，超声处理180s，20°C温浴30min，随后加入500V体积的0.1M HCl，混匀；P样品，加入500V体积的0.1M NaOH混匀，20°C温浴30min，随后加入500V体积的0.1M HCl，混匀；
[0010](e)染色:分别向以上T、P和B样品中加入100V体积的60μΜ Hoechest 33258(溶解于0.1M磷酸缓冲液中，pH=7.6)，混勾，25?30°C下1000rpm离心5min，整个过程避光；
[0011](f)荧光测定:根据不同检测器分别取对应量T，P和B样品上清液，于荧光检测器中测荧光强度，T，P和B样品的荧光强度分别记为f P、f B，和fT ；
[0012](g)结果计算:DNA链断裂指数SSF的计算，
[0013]首先，计算残留双链0嫩百分比？{=(办一作)/市一作)\100%
[0014]然后，根据所计算出的F值计算DNA链断裂指数，计算公式为
[0015]SSF = -ln(Ft/Fo)
[0016]其中，Fo为对照组的F值，由对照组的Po样品、To样品和Bo样品的荧光强度f计算得到;Ft为处理组的F值，由处理组Pt样品、Tt样品和Bt样品的荧光计算强度f得到。
[0017]与现有技术相比，本发明方法的优点和有益效果如下:
[0018](a)方法灵敏度高，DNA链上一个断裂位点即可检测到；
[0019](b)操作简便，不需要荧光显微镜及荧光定量PCR仪等分子生物学大型仪器，常规加热设备、超声发生设备加上荧光检测设备即可完成测试；
[0020](C)提高工作效率，单细胞凝胶电泳需要对每一个样品在荧光显微镜下单次拍照，耗时长，本方法通过96孔板可对大量样品进行高通量测定，测定一批样品可在4h内完成。
【附图说明】
[0021]图1为一种化感物质焦性没食子酸(PA)对铜绿微囊藻DNA链断裂的影响。
[0022]【附图说明】:铜绿微囊藻细胞在2mg/L焦性没食子酸(PA)暴露4、8和12h条件下，DNA链的断裂水平分别为0.08,0.14和0.17SSF(1SSF= 16000个断裂位点)。随着暴露浓度的升高和暴露时间的延长，DNA链的断裂水平呈现明显的时间效应和剂量效应，在50mg/L暴露12h的时候到达0.968SSF，相当于DNA链上有15488个断裂位点。这个测试结果表明，化感物质焦性没食子酸即使在2mg/L这样的低浓度作用条件下也能明显引起铜绿微囊藻DNA链的断裂，在高浓度化感物质暴露下，DN