冠心病早期诊断标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断领域,设及一种用于冠屯、病诊断的分子标志物,具体设及血 液中的分子标志物-SPEG基因在制备诊断冠屯、病的产品中的应用。
【背景技术】
[0002] 冠屯、病亦称为缺血性屯、脏病(coronary hea;rt disease,CHD),设及供应屯、肌血液 的动脉发生粥样硬化,即冠状动脉粥样硬化导致血管腔狭窄或斑块形成甚至破裂、完全堵 塞,限制或完全中断了屯、肌的血液供应,引起临床上屯、绞痛、屯、肌梗死等一系列严重的屯、肌 缺血病症。冠屯、病是现今威胁人类健康最严重的疾病之一,人类健康的主要杀手。随着经济 快速发展,世界范围的疾病谱发生了明显的变化,屯、血管疾病逐渐成为了主要疾病。在2008 年大概有1730万人死于屯、血管病,占全球死亡人数的30%。其中,死于冠屯、病的约有730万, 占了总数的近42%。有流行病学研究显示,到2020年,每年将有2500万人死于屯、血管疾病, 且屯、血管疾病预计将超过传染性疾病成为全球死亡和残疾的主要原因。虽然据世界卫生组 织MONICA资料统计,我国发病率较西方国家低,但我国冠屯、病发病率呈逐渐上升趋势。冠屯、 病的发生是许多因素参与的复杂过程,是环境因素和遗传因素共同作用的结果。众所周知, 冠屯、病的发病与吸烟,饮酒,肥胖,高血压,糖尿病,血脂异常等有关。但遗传因素起了独特 的作用,特别是家族遗传因素是冠屯、病的一个重要独立危险因素。基因检测可对冠屯、病防 治做出巨大贡献,发展疾病诊断和治疗新手段,具有很大前景。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种可用于冠屯、病早期诊断的分子标志物。相比传统的冠 屯、病的诊断方法,使用基因标志物来诊断冠屯、病具有及时性、特异性和灵敏性,从而使患者 在疾病早期就能知晓疾病风险,针对风险高低,采取相应的预防和治疗措施。
[0004] 为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0005] 本发明提供了检测SPEG基因表达的产品在制备诊断冠屯、病的工具中的应用。
[0006] 进一步,上面所提到的检测SPEG基因表达的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交、忍片或高通量测序平台检测SPEG基因表达水平W诊断冠屯、病的产品。
[0007] 进一步,所述用RT-PCR诊断冠屯、病的产品至少包括一对特异扩增SPEG基因的引 物;所述用实时定量PCR诊断冠屯、病的产品至少包括一对特异扩增SPEG基因的引物;所述用 免疫检测诊断冠屯、病的产品包括:与SPEG蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断冠 屯、病的产品包括:与SPEG基因的核酸序列杂交的探针;所述用忍片诊断冠屯、病的产品包括: 蛋白忍片和基因忍片;其中,蛋白忍片包括与SPEG蛋白特异性结合的抗体,基因忍片包括与 SPEG基因的核酸序列杂交的探针。
[0008] 在本发明的具体实施方案中,所述用实时定量PCR诊断冠屯、病的产品至少包括一 对特异扩增SPEG基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009] 优选地,所述诊断工具包括忍片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中,高通量测 序平台是一种特殊的诊断工具,检测SPEG基因表达的产品可W应用于该平台实现对SPEG基 因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展,对一个人的基因表达谱的构建将成为 十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱,容易分析出哪个基因的异 常与疾病相关。因此,在高通量测序中获知SPEG基因的异常与冠屯、病相关也属于SPEG基因 的用途,同样在本发明的保护范围之内。
[0010] 本发明还提供了一种诊断冠屯、病的工具,所述诊断工具包括忍片、试剂盒、试纸、 或高通量测序平台。
[0011] 其中,所述忍片包括基因忍片、蛋白质忍片;所述基因忍片包括固相载体W及固定 在固相载体的寡核巧酸探针,所述寡核巧酸探针包括用于检测SPEG基因转录水平的针对 SPEG基因的寡核巧酸探针;所述蛋白质忍片包括固相载体W及固定在固相载体的SPEG蛋白 的特异性抗体;所述基因忍片可用于检测包括SPEG基因在内的多个基因(例如,与冠屯、病相 关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质忍片可用于检测包括SPEG蛋白在内的多个蛋白质 (例如与冠屯、病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与冠屯、病的标志物同时检测, 可大大提高冠屯、病诊断的准确率。
[0012] 其中,所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测SPEG基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括SPEG蛋白的特 异性抗体。进一步,所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或忍片方 法检测SPEG基因表达水平过程中所需的试剂。优选度,所述试剂包括针对SPEG基因的引物 和/或探针。根据SPEG基因的核巧酸序列信息容易设计出可W用于检测SPEG基因表达水平 的引物和探针。
[0013 ] 与SPEG基因的核酸序列杂交的探针可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍 生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核巧酸序列特异性结合,任 何长度都可W。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长 度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交 效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过 30个碱基对,与目的核巧酸序列互补的长度W15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列 最好少于4个碱基对,W免影响杂交效率。
[0014] 所述高通量测序平台包括检测SPEG基因表达水平的试剂。
[0015] 所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核巧酸,所述寡核巧酸能够检测 SPEG基因的转录水平。
[0016] 进一步,所述SPEG蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述SPEG蛋白 的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如,,嵌合抗体、scFvJab、F (ab')2、Fv等。只要所述片段能够保留与SPEG蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体 的制备时本领域技术人员公知的,并且本发明可W使用任何方法来制备所述抗体。
[0017] 在本发明的具体实施方案中,所述针对SPEG基因的引物序列如下:正向引物序列 如SEQ ID NO. 3所示,反向引物如SEQ ID NO.4所示。
[0018] 用于诊断冠屯、病的SPEG基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿 液、唾液、脊髓液等可W获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中,用于诊断冠屯、 病的SPEG基因及其表达产物的来源是血液。
[0019]在本发明的上下文中,"SPEG基因"包括SPEG基因 w及SPEG基因的任何功能等同物 的多核巧酸。SPEG基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中SPEG基因(NC_ 000002.12)DNA序列具有70% W上同源性,且编码相同功能蛋白质的DM序列;
[0020] 优选地,SPEG基因的编码序列包括W下任一一种DNA分子:
[0021] (1)序列表中沈Q ID N0.1所示的DNA序列;
[0022] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
[0023] (3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地,90% W上同源性,且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0024] 在本发明的具体实施方案中,所述SPEG基因的编码序列是SEQ ID N0.1所示的DNA 序列。
[0025] 在本发明的上下文中,SPEG基因表达产物包括SPEG蛋白W及SPEG蛋白的部分肤。 所述SPEG蛋白的部分肤含有与冠屯、病相关的功能域。
[0026] "SPEG蛋白"包括SPEG蛋白W及SPEG蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 SPEG蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、天然突变体、诱 导突变体、在高或低的严紧条件下能与SPEG的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0027] 优选地,SPEG蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质:
[00%] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0029] (2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个,较佳地1-30 个,更佳地1-20个,最佳地1-10个。
[0030] (3)与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性), 更优选地,与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性,常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肤。
[0031] 在本发明的具体实施方案中,所述SPEG蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0032] 通常,已知的是,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0033] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是SPEG蛋白的融合 蛋白。对于与SPEG蛋白融合的肤或者蛋白质没有限制,只要所得的融合蛋白保留SPEG蛋白 的生物学活性即可。
[0034] 本发明的SPEG蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰,只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留SPEG蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的 氨基酸数目通常是10个或者更少,例如6个或者更少,例如3个或者更少。
[0035] 在本发明的上下文中,"诊断冠屯、病"既包括判断受试者是否已经患有冠屯、病、也 包括判断受试者是否存在患有冠屯、病的风险。
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