高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法和定量试剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及高密度脂蛋白3(下文有时称为"HDL3")中的胆固醇（下文有时将HDL3 中的胆固醇称为"HDL3胆固醇"或"HDL3-C'）的定量方法和定量试剂。
【背景技术】
[0002] 高密度脂蛋白（皿L)胆固醇，由于从包括动脉硬化壁的各组织接受胆固醇而与在 细胞内蓄积的胆固醇的除去作用相关，因此也被称为胆固醇逆向转运体系。已知其与冠状 动脉硬化等动脉硬化疾病存在负相关，皿L为低值作为一种血脂异常症已规定了低值界限， 已知其作为动脉硬化的指标是有用的。
[0003] 皿L由脱辅基蛋白和憐脂、胆固醇、中性脂肪构成。皿L的比重为d=l.063~1.210,进 一步分类为d=l. 063~1.125的皿L2和d=l. 125~1.210的皿L3运两个级分。根据脂蛋白的分布 曲线可在d=l. 125部分确认到凹痕(notch),从该处起比重更重的部分被作为皿L3。此外，还 存在根据皿L中的脱辅基蛋白中载脂蛋白E的含量差，将载脂蛋邮含量多的皿L作为富载脂 蛋白E( 7求6-'1油)皿L的亚级分的分类方法。
[0004] 已知不仅迄今为止的HDL蛋白整体，而且在HDL2和HDL3各自的亚级分中也显示出 不同的作用。在临床中，已知CETP缺陷会导致皿L不被代谢为LDL、IDL，从而皿L胆固醇量增 加。由于CETP缺陷而增加的HDL是HDL2。据信，HDL2中存在抗动脉硬化作用。此外，据信CETP 缺陷会导致富载脂蛋白E HDL上升，还据信富载脂蛋白E HDL的胆固醇拔除能力强，具有抗 血小板作用，在皿L中也是更有益的。此外，卵憐脂胆固醇酷基转移酶化CAT)活性的降低会 导致HDL3不转变成HDL2,从而HDL3增加。暗示了 HDL3的增加所致的冠状动脉疾病的发病率 的增加。根据运些倾向，预计对皿L亚级分各自进行测定将有助于判断动脉硬化疾病的有无 和原因。此外，现在各制造商都在推进根据运些皿L亚级分的作用来开发抑制CETP的作用、 减少LDL胆固醇量并增加皿L胆固醇量的治疗药物。
[000引确立皿L亚级分的简便测定方法可能关系到阐明详细的机理和其治疗的效果。
[0006] 迄今为止，作为皿L亚级分的测定方法而已知的，已知有超速离屯、法、高效液相色 谱(HPLC)法、皿L3沉淀法(专利文献1)、NMR法等。
[0007] 超速离屯、是利用脂蛋白比重的不同通过离屯、来分级的方法，其缺点在于操作需要 熟练、耗费多日，此外费用也高昂。根据冈崎等人的使用HPLC分离HDL2和HDL3的方法中，操 作需要时间，还需要特别的机器。HDL3沉淀法是通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂 将HDL3之外凝集，通过离屯、回收上清液部分的HDL3并在自动分析装置中进行测定的方法。 同样地，其缺点在于操作需要熟练，此外还在于其是手工操作并且还需要样本的预处理操 作，到测定为止要耗费一定的时间，因此其不是普遍通用的。此外，NMR法是利用磁共振来测 量脂蛋白的粒子数的方法，但其需要特殊的机器，不具有一般性。
[0008] 尚需说明，还存在皿L亚级分的分析方法（专利文献2)。虽然可W通过通用自动分 析装置来测定，但由于其采用了基于使用表面活性剂来抑制皿L3之外的脂蛋白不受酶的作 用的方法，在皿L3的反应中存在目标之外的脂蛋白，有可能对测定产生影响、或者在没有完 全抑制时有可能将皿L3W外的脂蛋白测定在内。
[0009] 需要发明和运些方法不同的、简便并且能更有选择性地对胆固醇量进行定量的试 剂。
[0010] 现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2009-207463号公报 专利文献2:日本特开2001-346598号公报。
【发明内容】
[0011] 发明要解决的问题 本发明的目的是提供不需要烦杂的操作就可W对被检试样中的HDL3定量的方法和试 剂。
[0012] 用于解决问题的技术手段 本申请的发明人进行了深入研究，结果发现了与HDL3特异性地反应的表面活性剂。进 而想到可W通过使被检试样与运样的表面活性剂反应并对胆固醇定量从而对被检试样中 的皿L3胆固醇定量，并在实验上确认了运是可能的，从而完成了本发明。
[0013] 目P，本发明提供高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，所述方法包括使被检试样 与和高密度脂蛋白3特异性地反应的一种或两种W上的表面活性剂反应并对胆固醇定量， 当所述表面活性剂为一种时，该表面活性剂是选自化B为12.5~15的聚氧乙締多环苯基酸中 的一种，当所述表面活性剂为两种W上时，该表面活性剂的至少一种是选自聚氧乙締多环 苯基酸中的至少一种，并且W两种W上的表面活性剂整体的化B为12.5~15的方式来组合两 种W上的表面活性剂。此外，本发明提供高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量试剂，所述试剂 包含和高密度脂蛋白3特异性地反应的一种或两种W上的表面活性剂，当表面活性剂为一 种时，该表面活性剂是选自化B为12.5~15的聚氧乙締多环苯基酸中的一种，当所述表面活 性剂为两种W上时，该表面活性剂的至少一种是选自聚氧乙締多环苯基酸中的至少一种， 并且W两种W上的表面活性剂整体的化B为12.5~15的方式来组合两种W上的表面活性剂。 进一步，本发明提供上述本发明的试剂的用于高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量的用途。
[0014] 发明效果 根据本发明，可W不需要超速离屯、和前处理等烦杂的操作，通过自动分析装置特异性 地对被检试样中的皿L3胆固醇定量。此外，由通过作为现有技术的样本中皿L总胆固醇定量 法得到的总皿L胆固醇量算出与皿L3胆固醇量之差，由此可W对皿L2胆固醇量进行定量。
【附图说明】
[0015] 图1:是示出本发明实施例3中进行的包括聚氧乙締苯乙締化苯基酸的各种聚氧乙 締多环苯基酸的HLB、与皿L3/皿L2反应比的关系的图。
[0016] 图2:是示出本发明实施例5中进行的通过本发明求出的HDL3胆固醇、与通过沉淀 法求出的皿L3胆固醇的相关关系的图。
[0017] 图3:是示出本发明实施例5中进行的由通过本发明求出的HDL3胆固醇和总皿L胆 固醇利用计算求出的HDL2胆固醇、与由通过沉淀法求出的HDL3胆固醇和总皿L胆固醇利用 计算求出的皿L2胆固醇的相关关系的图。
[0018] 图4:是示出本发明实施例6中进行的通过本发明求出的HDL3胆固醇、与通过超速 离屯、法求出的皿L3胆固醇的相关关系的图。
[0019] 图5:是示出本发明实施例6中进行的由通过本发明求出的HDL3胆固醇和总皿L胆 固醇利用计算求出的皿L2胆固醇、与通过超速离屯、法求出的皿L2胆固醇的相关关系的图。
【具体实施方式】
[0020] 作为供于本发明的方法的被检试样，只要是意欲对该试样中的HDL3胆固醇进行定 量的被检试样则没有特别的限制，但优选血清、血浆或它们的稀释物，特别优选血清或其稀 释物。
[0021 ]本发明中，对于表面活性剂使用术语"反应"时，意指酶对表面活性剂比对脂蛋白 更容易起作用，或者保护脂蛋白使酶不能对其起作用。
[0022] 在本发明的方法中，使被检试样与和HDL3特异性地反应(和HDL3之外的脂蛋白几 乎不反应)的表面活性剂反应。作为和皿L3特异性地反应的表面活性剂，为包含聚氧乙締多 环苯基酸的至少一种。在聚氧乙締多环苯基酸中，优选聚氧乙締苯乙締化苯基酸，更优选聚 氧乙締二苯乙締化苯基酸。
[0023] 更具体地，作为聚氧乙締多环苯基酸，可列举出化wcol-610(商品名，日本乳化剂 公司生产，在下文中公司名是指制造公司，一并记载公司名的都是商品名）、化wcol-710(日 本乳化剂）、7尹'力b-瓜口(：-10(7尹'力）、7尹'力b-瓜口(：-13(7尹'力）、7尹'力b-瓜SP-12 (7尹'力），在聚氧乙締多环苯基酸中，作为聚氧乙締苯乙締化苯基酸，可列举出工7/レクシ A60(花王）、工7/レクシA90(花王）、方弓。7シDSP-12.5(青木油脂）、方弓。7シTSP-16 (青木油脂）、/斗クシEA-137(第一工业制药）、/斗クシEA-157(第一工业制药）、/斗クシ EA-167(第一工业制药）。在其中，工7/レクシA60(花王）、工7/レクシA90(花王）、化wcol- 710(日本乳化剂)被分类为聚氧乙締二苯乙締化苯基酸。运些表面活性剂可W单独使用，也 可W组合两种W上使用。
[0024] 和皿L3特异性地反应的表面活性剂的化B优选为12.5~15，进一步更优选13.5~ 14.5。可W是一种表面活性剂且化B为12.5~15,也可W将包括化B不为12.5~15的表面活性 剂在内的两种W上W表面活性剂整体的HLB落在12.5~15之中的方式进行组合。
[002引和HDL3特异性地反应的表面活性剂的浓度W终浓度计优选为0.025~5.0%(w/v)， 进一步优选为0.25~2.5%(w/v)。
[0026]在本发明的方法中，通过上述表面活性剂的反应对胆固醇定量。胆固醇的定量方 法本身是公知的，可W采用公知的任意一种方法，下述实施例中也有具体记载。例如，对脂 蛋白中的醋型胆固醇使用胆固醇醋酶