一种玉米开花调控蛋白、编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，更具体的说，涉及一种与玉米开花性相关的调控蛋白、 编码基因及应用。
【背景技术】
[0002] 植物开花不仅影响着植物能否正常的繁衍后代，而且直接关系到农作物的产量。 已有研究表明，开花素通过运输系统到达顶端分生组织，激活其他基因的表达，最终促使植 物开花。作物开花转换时间决定了不同品种的作物在不同区域的适应能力和产量。因此， 对作物开花调控基因的克隆和鉴定对农业生产具有重要的理论意义和应用前景。
[0003] 各种植物在经过足够的营养生长后就会在合适的环境下从营养生长转变到生殖 生长。种子植物复杂而精确的调控网络确保植株在最适条件下开花，完成后代的繁殖。开 花时间是由多种基因被外界特定的时空环境诱导表达并相互作用所后决定：首先，植物生 长到一定阶段，通过叶片等部位可以感受到外界开花诱导因子，诱导因子激活整合因子，整 合因子进一步促进花分生组织特定基因和花器官分生组织基因的表达，最后通过激活多个 花器官决定基因形成花。研究发现植物具有环境温度（ambient temperature)、光周期途径 (photoperiod)、自主途径（autonomous)、春化途径（vernalization)、年龄（age)和赤霉素 (gibberellin)等六条开花调控途径。
[0004] 在模式植物拟南芥中，开花调控途径研究的最为清楚。光周期响应因子是C0基 因，春化途径和自主途径有共同的响应因子FLC基因，年龄发育响应因子为SPL基因，而赤 霉素途径响应因子则是S0C1基因，SVP基因同时可以响应赤霉素，自主和春化等途径。这 些响应因子并不能直接与花器官决定因子产生作用，需要一些能够传递到开花控制相关的 核心因子，即开花信号整合因子，如拟南芥中的FT基因和S0C基因。这些整合因子接受开 花促进信号或者开花抑制信号后，单独或与其他蛋白相互作用后形成多聚体，作用于花分 生组织决定基因 LFY和AP1，促使这些基因的表达量上升或者下调，这些基因也组成二聚体 或者多聚体调节使花器官建成因子表达，花器官形成。
[0005] S0C1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF C0NSTANS1)基因广泛存在于种子（单 子叶和双子叶）植物中，它属于MIKC转录因子家族。S0C1在拟南芥的各种开花调控途径中 具有重要作用，它不仅是信号通路中的响应因子，同时还是整合这些调控路径中的信号整 合因子，能够调节开花时间。
[0006] 另一个转录因子AGL24是MADS转录因子家族一员，光周期途径、GA途径、春化途径 和自主途径都会影响AGL24表达，AGL24在叶片、根、茎和花序组织中均广泛地表达，并且在 这些组织中的时空表达模式与S0C1相同。微阵列（Mircoarray)分析表明：AGL24和S0C1 能够通过结合到对方的启动子上相互提高对方的表达水平，在赤霉素开花途径中，AGL24与 S0C1通过蛋白互作方式来调控LFY的表达，表明了开花整合信号AGL24和S0C1能互相形成 正反馈回路。FT-FD蛋白与S0C1蛋白形成复合体后，在顶端分生组织中激活了花分生组织 特性基因 API、FML和LFY的表达，进而在顶芽中启动花器官的形成。在植物中，并非所有 的S0C1同源基因均具有促进开花的功能，如矮牵牛UNS (UNSHAVEN)基因与拟南芥S0C1是 同源基因，但是UNS的作用却与S0C1相反，它对花分生组织基因的表达和花器官的建成具 有负调控作用。
[0007] 在花芽形成的过程中，LFY主要受S0C1调节，API主要受FT调控。当花分生组织 特异性基因发生突变时，植物会产生茎芽而不是花芽。S0C1可以诱导LFY茎尖表达形成分 生组织，过量表达S0C1的植株会促使LFY表达量升高，而S0C1功能缺失性突变体则降低了 LFY的表达。拟南芥染色质免疫沉淀实验表明，S0C1蛋白是通过与AGL24结合形成聚合体 后再进入细胞核，然后直接与LFY启动子中的CArG域结合，激活LFY基因的转录来调控相 应蛋白的含量，从而促进开花。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于：提供一种玉米开花调控蛋白、编码基因及应用，该调控蛋 白、编码基因来源于玉米B73。
[0009] 在本发明的第一方面，提供玉米开花调控蛋白，名称为ZmSOCl蛋白，来源于玉米 B73,属MADS类转录因子，是如下a)或b)的蛋白：
[0010] a)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] b)在序列表中序列9的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸且与开花相关的由a)衍生的蛋白质。
[0012] 其中，序列表中序列9包括232个氨基酸。本发明的ZmSOCl蛋白可人工合成，也 可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0013] 在本发明的第二方面，提供玉米开花调控编码基因，名称为ZmSOCl基因，所述玉 米开花调控编码基因是如下1)或2)或3)的基因：
[0014] 1)其核苷酸序列是序列表中序列8 ;
[0015] 2)在严格条件下与序列8限定的DNA片段杂交且与植物开花相关蛋白的DNA分 子；
[0016] 3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码与植物开花相关的蛋白的 DNA分子。
[0017] 其中，序列表中序列8由696个核苷酸组成，编码序列表中序列9所示的蛋白。
[0018] 扩增ZmSOCl基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0019] 含有上述ZmSOCl基因的重组载体也属于本发明的保护范围。
[0020] 在本发明的第三方面，本发明对ZmSOCl蛋白、ZmSOCl基因的功能进行了研究，表 明该基因和其编码的蛋白是可以显著促进植物的开花，在调控植物开花方面具有重要的应 用前景，可以作为转基因植物的目的基因，ZmSOCl蛋白、ZmSOCl基因、包含ZmSOCl基因的重 组表达载体在转基因植物中的应用属于本发明的保护范围。
[0021] 本发明把ZmSOCl基因构建到植物表达载体上，启动子为Ubiqutin，得到过表达质 粒，将其转化到农杆菌EHA105中，用农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。把转基因植 株与未转基因的野生型植株在正常生长条件下进行比较，结果表明，ZmSOCl基因的过表达 导致植物开花提前，说明ZmSOCl基因参与了植物的开花调控。
【附图说明】
[0022] 以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中：
[0023] 图1为ZmSOCl蛋白的亚细胞定位图；
[0024] 图2为ZmSOCl蛋白在逆境条件下的表达；
[0025] 图3为ZmSOCl过表达载体图谱；
[0026] 图4为ZmSOCl转基因拟南芥开花时莲座叶统计。
【具体实施方式】
[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 实施例1ZmSOCI基因的克隆
[0031] 以玉米B73的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR引物如下：
[0032] 上游引物，即引物序列1 :
[0033] 5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGTGCGGGGCAAGACGCAGAT-3' ；
[0034] 下游引物，即引物序列2 :
[0035] 5, -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCTGACCTGACCGCCACTG-3,。
[0036] 扩增条件：
[0037]
[0038] 扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收，利用GATEWAY重组系统的BP反应将PCR产 物重组到PD0NR221载体，转化E. coli，酶切鉴定后测序。测序结果表明：成功获得了玉米 ZmSOCl基因的CDS序列，其序列如序列8所7K，大小为696bp。将该基因命名为ZmSOCl基 因，其编码蛋白的氨基酸序列如序列9所示。
[0039] 实施例2拟南芥ZmSOCl亚细胞定位分析
[0040] 转录因子的特征之一是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为 此，利用原生质体转化的方法在原生质体中对玉米ZmSOCl蛋白的亚细胞定位进行了研究。
[0041] 载体构建：利用GATEWAY的LR反应将pD0NR221载体上的ZmSOCl基因重组到 PK7WFG2载体上，与GFP(绿色荧光蛋白）形成融合基因表达载体，由35S启动子驱动表达。
[0042] 拟南芥叶片原生质体的制备：选取长势良好的拟南芥叶子，用刀片切成0. 5mm宽 的叶条。将切好的叶条放入预先配置好的酶解液（1. 5% Cell μ Lase R10, 0. 4% macerozyme RIO, 0· 4M mannitol, 20mM KC1，20mM MES，pH 5· 7, lOmM CaC12, and 0· 1 % BSA)中（每 5-10ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液，50转/分钟 条件下酶解5~6h。
[0043] 原生质体的转化：
[0044] 1) 100g离心10分钟使原生质体沉淀在管底，然后用适量MMG溶液（0. 4M mannitol, 15mM MgCl2, and 4mM MES，pH 5. 7)重悬原生质体，使之最终浓度在2X 105个/ ml〇
[0045] 2)每 100μL 原生质体加入 10μL DNA(10uLDNA 约 5-10kb 的质粒 DNA)至 2ml 离 心管中，轻柔混合。
[0046] 3)力卩入等体积 110 μ 1 PEG 溶液（40 % PEG[v/v]，0· 2M mannitol, and 0· 1M CaCl2)，轻柔拍打离心管完全混合。诱导转化混合物10分钟。
[0047] 4) 100g 离心 2 分钟去上清后，用 lmL WI 溶液（0· 5M mannitol, 20mM KC1,4mM MES，pH5. 7)轻柔重悬原生质体。