多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及多肽、包含该多肽的检测器件及检测试剂盒，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]疟疾是一种急性传染病，是目前世界上对人类危害最为严重的蚊媒寄生原虫病，病原体是疟原虫，症状为周期性发冷发热。由于疟原虫的生活周期复杂，抗原具有阶段特异性等特点，疟疾的防治成为世界性的难题之一。其中，恶性疟疾每年感染3 — 5亿人，夺取数百万人的生命。2011年11月，世界卫生组织最新统计有2.16亿疟疾病例发生，死亡率高达655，000人。疟原虫主要分布在地球热带、亚热带各国，S卩非洲、东南亚、南美等地区，约有20亿人口仍生活在疫区，每年死于疟疾的儿童约100万。我国在华南、华中的某些地区，特别是云南和海南省为高发区。因此，疟疾也严重阻碍着发展中国家的经济发展。
[0003]由于疟疾治疗药物的特殊性，精确快速的诊断不仅能及时发现并治疗疟疾患者，大大降低病死率，也能通过早期排除疟疾，及时挽救感染了其它传染性疾病患者的生命。以此同时，精确快速的早期诊断也是对疟疾实时流行病监测和控制的必要手段。目前，诊断疟疾的经典方法仍为血涂片显微镜检法，该方法对检验者的技能和检验要求很高，远远无法满足非洲和南美洲等发展中国家中绝大多数生活在偏远地区患者的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种对疟疾的诊断有用的多肽、抗该多肽的抗体、包含该多肽的检测器件、包含该多肽或该检测器件的检测试剂盒、以及该多肽在检测疟原虫引起的疾病(例如疟疾)中的用途、该多肽在制备用于检测疟原虫引起的疾病(例如疟疾)的试剂盒或检测器件中的用途。
[0005]S卩，本发明包含下述技术方案:
1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的多肽。
[0006]2.一种检测器件，其包括:
固体载体，以及
连接于该固体载体上的项I所述的多肽。
[0007]3.根据项2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。
[0008]4.一种检测试剂盒，其包括项I所述的多肽、或者项2或3所述的检测器件。
[0009]5.抗项I所述的多肽的抗体。
[0010]6.项I所述的多肽在制备用于检测疟原虫引起的疾病的试剂盒或检测器件中的用途。
[0011]7.项6所述的用途，其中，所述疾病是疟疾。
[0012]8.项6或7所述的用途，其中，所述疟原虫是恶性疟。
[0013]9.编码项I所述的多肽的核酸。
[0014]10.包含项9所述的核酸的表达载体。
[0015]11.导入了项10所述的表达载体的宿主细胞。
[0016]将本发明的多肽应用于疟原虫引起的疾病(例如疟疾)的诊断，能够取得令人满意的效果。
【附图说明】
[0017]图1将多肽通过化学共价固定于SJ改性硅胶表面的示意图。
[0018]图2对SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)的制作过程进行说明的示意图。
[0019]图3对多肽微阵列化学固定过程进行说明的图。
[0020]图4说明多肽微阵列点样模式的示意图。
[0021]图5是显示对健康正常人或非疟疾病人血清进行检测的结果的照片。
[0022]图6是显示对疟疾病人血清进行检测的结果的照片。
【具体实施方式】
[0023]本发明的多肽
本发明的多肽是30肽。本发明的30肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成，即:EIKKQVEEGIKENDTEGNDKVKGPEIITEE。如实施例所示，其对疟疾病人的血清呈阳性反应，而对健康正常人或非疟疾病人血清呈阴性反应。因此，该30肽作为疟原虫(例如恶性疟)引起的疾病(例如疟疾)的诊断工具是有用的。
[0024]本发明的多肽在有市售的情况下，可以使用市售品，此外，还可以适宜采用⑴化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
[0025]此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子W02004/011653号所述的方法。S卩，可以这样来生产:将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出:具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
[0026]而且，除了上述的酶方法、化学合成方法以外，有些情况下，本发明的多肽还可能是天然存在(但未被分离出来)的。在天然存在的情况下，还可以将其分离出来。
[0027]本发明的核酸、表达载体宿主细胞，以及抗本发明的多肽的抗体
本发明还涉及编码该多肽的核酸(本发明的核酸)、包含该核酸的表达载体(本发明的表达载体)、导入了该表达载体的宿主细胞(本发明的宿主细胞)，它们优选可用于生产本发明的多肽。本发明的核酸、表达载体、宿主细胞可以采用本领域技术人员公知的方法来制备。本发明还涉及抗本发明的多肽的抗体，其可用于检测本发明的抗体。本发明的抗体可以采用本领域技术人员公知的方法来制备。
[0028]本发明的检测器件本发明还涉及一种检测器件(本发明的检测器件)，其包括固体载体、以及连接于该固体载体上的本发明的多肽。
[0029]在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
[0030]构成固体载体的材料包括但不限于:硅胶(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纤维素、特氟隆?、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组入坐I=I 寸 O
[0031]固体载体的形状包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
[0032]在本发明中，磁珠可以具有约25ηπΓ约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约50ηπΓ约1ym范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0033]在本发明中，由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24 μ πΓ约165 μ m范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24 μ πΓ约44 μ m范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0034]具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
[0035]二氧化硅(S12)-处理或二氧化硅(S12)基的固体载体的例子包括可从Polysciences, Warrington,PA购买的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，还可以使用可从Dynal B1tech购买的M-280等。
[0036]具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出Polysciences, Warrington, PA销售的珠子(名称:B1mag(注册商标)竣基)、或者 Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN 的名称为 MC02N/2928 的珠子。或者，可以使用Dynal B1tech销售的M-270等。
[0037]在本发明的一个优选实施方式中，所述固体载体是SJ改性硅胶。苏州傯聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜，参见中国专利CN101265329A)。这种材料是以生物学研究常用的PDMS为基础，在其中加入特定的引发剂成份(使该材料可通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面功能化修饰)，再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol) methacrylate)，pOEGMA)表面修饰获得的。SJ改性娃胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecific protein adsorpt1n, NPA)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对O”水平(接近或低于仪器的检测极限)，不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州傯聚公司已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒，实现了高通量和高灵敏的检测，证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时，这种材料还具有表面性质可调的特性，可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
[0038]本发明的多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如，对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[l-ethyl-3-(3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-轻基玻拍酷亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反应将改性石圭胶表面高分子链上的羧基(-C00H)基团改为活化基团，该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基(-NH2)反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面(参见图1)。
[0039]对于点样时使用的点样液中本发明的多肽的浓度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为I μ g~1000 μ g/mL,更优选10 μ g~500 μ g/mL。此外，对于本发明的多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为Γ100 点 /10mm2，更优选 5?50 点 /1mm20
[0040]本发明的检测器件可以用于检测疟原虫引起的疾病(例如疟疾)、或者制备用于检测疟原虫引起的疾病(例如疟疾)的试剂盒。
[0041]本发明的检测试剂盒
本发明还涉及一种检测试剂盒(本发明的检测试剂盒)，其