用于检测黄曲霉毒素m1的单克隆抗体及酶联免疫方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别黄曲霉毒素Ml 的单克隆抗体和一种用于检测黄曲霉毒素Ml的酶联免疫方法(ELISA)。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌的次级代谢产物。其是一类结构相似 的化合物，都含有二呋喃环和香豆素。其有20多种，目前分离鉴定的有12种，常见的主要为 黄曲霉毒素8132、61、62、]?1、]\12。黄曲霉毒素11主要污染牛奶及其奶制品，黄曲霉毒素11的 毒性极强，且具有致癌性。随着人们生活水平的提高，人们对奶制品的需求量越来越大，因 此加强对牛奶中黄曲霉毒素Ml的残留监控十分必要。
[0003] 目前检测黄曲霉毒素Ml的方法主要为仪器方法和免疫学方法。仪器方法虽然灵 敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的 前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常 高；而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器，因此需要 建立一个从筛选到确证的检测体系。仪器方法显然不适用于样品的大量筛选。免疫化学分 析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合 高通量样品筛选，因此对于快速检测黄曲霉毒素的残留，ELISA方法更具优势。而制备较高 灵敏度的抗体是ELISA方法的根本，只有制备出较高灵敏度的抗体，才能制备出具有竞争性 的ELI SA试剂盒。江涛等（2007)制备了抗AFM1的单克隆抗体并建立了ELI SA方法，标准曲线 的线性范围为0.02~2ng/mL，该方法的检出限为0.07ng/mL;张园园等(2008)以AFM1-BSA为 免疫原，制备了抗AFM1抗体，该抗体的检出限为0.08ng/mL，线性范围为0.08~5ng/mL。因此 现有抗体的检测灵敏度不够高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的为：
[0005] (1)提供一种能特异性识别黄曲霉毒素Ml的单克隆抗体；
[0006] (2)提供所述单克隆抗体在制备黄曲霉毒素Ml酶联免疫检测试剂盒中的应用；
[0007] (3)提供一种能检测黄曲霉毒素Ml的酶联免疫试剂盒；
[0008] (4)利用该单克隆抗体，建立一种能检测黄曲霉毒素Ml的ELISA方法；
[0009] 上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 一种能特异性识别黄曲霉毒素Ml的单克隆抗体，它是杂交瘤细胞株AFM1/3D8所分 泌的。
[0011]所述的杂交瘤细胞株AFM1/3D8,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201559。
[0012]所述的单克隆抗体是以黄曲霉毒素Ml (AFM1)与羧甲基羟胺半盐酸盐(CM0)反应生 成黄曲霉毒素Ml肟(AFM10)，将AFM10与载体蛋白偶联，得到的偶联物作为免疫原制备得到 的。本发明中优选的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)。
[0013] 所述的单克隆抗体用于建立相应的ELISA方法。
[0014] 所述的单克隆抗体可以用于制备检测黄曲霉毒素Ml的酶联免疫检测试剂盒。
[0015] 一种检测牛奶中黄曲霉毒素Ml残留的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗体的制 备，间接竞争ELISA方法的建立，其步骤如下：
[0016] (1)将AFM1与CM0在碱性条件下反应得到的半抗原AFM10;
[0017] (2)用EDC方法将AFM10与载体蛋白偶联，得到免疫原；
[0018] (3)用EDC方法将黄曲霉毒素B1肟(AFB10)与载体蛋白偶联后得到包被原；
[0019] (4)用步骤(2)得到的免疫原制备出了保藏号CCTCC N0:C201559的杂交瘤细胞株 AFM1/3D8；
[0020] (5)用保藏号为CCTCC N0:C201559的杂交瘤细胞株AFM1/3D8制备单克隆抗体；
[0021] (6)用步骤(3)得到的包被原包被固相载体；
[0022] (7)样品前处理：取牛奶样品10±0.5mL于50mL离心管中，4000r/min离心5min，取 上清，即为待测物溶液；
[0023] (8)对待测物溶液进行酶联免疫检测。
[0024] 优选地，上述方法中免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)，包被原载体蛋白是卵清白 蛋白（0VA)。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1)本发明在制备单克隆抗体时，采用黄曲霉毒素Ml肟为半抗原，由该半抗原偶联 蛋白得到免疫原，采用该免疫原制备的单克隆抗体能特异性识别黄曲霉毒素Ml;
[0027] 2)本发明建立的ELISA方法和试剂盒能特异性检测黄曲霉毒素Ml，而且检测灵敏 度、准确度高，精密度好，IC5Q值达到了 64.75ng/L，线性范围5~405ng/L。
【附图说明】
[0028]图1为本发明的单克隆抗体与黄曲霉毒素Ml标准品的间接竞争ELI SA反应标准曲 线图，X轴为黄曲霉毒素Ml (AFM1)标准溶液浓度对数值，Y轴为黄曲霉毒素标准品溶液的光 密度值除以"零"孔光密度值(B/Bo)。
【具体实施方式】
[0029] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0030] 实施例1免疫原和包被原的制备
[0031] 1.1免疫原的制备
[0032] 取2mL浓度为lmg/mL的AFM1甲醇溶液，加入3mg CM0和5mg的碳酸钠，在室温下搅拌 反应24h，然后用氮气吹干，加入0.05mol/L的盐酸2mL，将其充分溶解，加入2mL的乙酸乙酯 萃取，取乙酸乙酯层，重复3次;将取得的液体在氮气下吹干，即得到半抗原，反应如下：
[0033]
[0034] 用DMF将得到半抗原溶解，并加入lOmg的EDC和5mg的NHS，活化12h，为A液;将2mL的 KLH溶于5mL的PBS溶液中，为B液。然后将A液缓慢加入B液中，在冰浴条件下反应12h;待反应 完全后，经其装入透析袋中，于PBS溶液中透析3~5天，每天换液3次。即得到完全抗原AFM1-EDC-KLH，反应如下：
[0035]
一...3
[0036] 1 · 2包被原 AFB1-EDC-0VA的制备
[0037] 将半抗原AFB10溶于DMF中，加入12mg的EDC和5mg的NHS，活化4h，为A液；将15mg的 0VA溶于5mL的PBS溶液中，为B液;然后将A液缓慢加入B液中，在冰浴条件下反应12h;待反应 完全后，经其装入透析袋中，于PBS溶液中透析3~5天，每天换液3次。即得到完全抗原AFB1-EDC-0VA，反应如下：
[0038]
[0039]实施例2单克隆抗体的制备
[0040] 2.1动物免疫
[0041] 利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的黄曲霉毒素Ml肟与血蓝蛋白 偶联物(AFM1-EDC-KLH)免疫Balb/C小鼠（购自湖北省医学科学院实验动物中心）。免疫程序 是取含AFM1-EDC-KLH偶联物50~80yg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产 生特异性血清。
[0042] 2.2细胞融合和克隆化
[0043] 参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的 AFM1-EDC-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心），免疫 程序为:基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以 后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后 休整1月）腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。
[0044] 融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性 血清），在75%酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/ 〇骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1~2X10 7个和108个免疫脾细胞，其比例 在1:10~1:15之间，将其都置于50mL离心管中，用15mL的RPMI-1640基础液重悬细胞， 1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇 (PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上 清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，吸取〇. 8mL的PEG， 手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边 加边轻轻搅拌，lmin内加完，持续搅拌30s。然后加入10mL基础培养液，沿管壁缓慢加到融合 细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打），在5min内加入，最后补加基础培养液到40mL，加完后， 盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min 5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的 HAT培养基lmL，缓慢加入，并轻轻搅动，忌吹打;然后将该细胞逐滴滴入到含饲养细胞的血 清瓶中，混合均匀，然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融 合可接种4~6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含 1 〇4左右个SP2/0细胞。于37 °C，5 % C02培养箱中培养。
[0045]融合的当天计为Od，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补 加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出1/2培养上清（100μυ，再加入1滴HT完全培养基；以后 每隔2d同上法吸去1/2~3/4培养上清，在7d后换入ΗΤ完全培养基。
[0046]待融合细胞集落长至培养孔的1/4左右，用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零 药物孔相比，药物孔0D值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2~6 个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。
[0047]经过3~4次克隆，最终筛选出分泌抗黄曲霉毒素Ml的单克隆抗体杂交瘤细胞株， 申请人将其命名为AFM1/3D8,并于2015年4月24日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO: C201559。对该细胞系进行了染色 体计数，结果显示，SP2/0的染色体数为62~68条，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染 色体数目平均值为99.1条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞 株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自Thermo Sxientific公司的鼠单克隆 抗体(Monoclonal antibody，Mab)快速ELISA同型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的 亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠IgGi亚型。
[0048] 实施例3 AFM1间接竞争ELISA检测方法的建立
[0049] 3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制）
[0050] 磷酸盐缓冲液:NaCl 8.0g，KH2P〇4〇.2g，Na2HP〇4 · 12H20 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水 至 lOOOmL，调节 pH至7 · 4;
[0051 ]包被液：取Na2C03l. 59g，NaHC032.93g，加三蒸水至 1000mL，调节pH值至9.6;
[0052] 洗涤液：NaCl 8.0g，KH2P〇4〇.2g，Na2HP〇4 · I2H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5mL， 加双蒸水至l〇〇〇mL，调节pH至7.4;
[0053] 封闭液:脱脂奶粉1.5g溶于lOOmL磷酸盐缓冲液中；
[0054] 底物液A:3,3'，5'，5_四甲基联苯二胺（TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至 1000mL；
[0055] 底物液B : Na2HP0U4.6g，梓檬酸9.3g，0.75 %过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至 1000mL；
[0056] 底物混合液:将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；