一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供特异识别人耳蜗、皮肤组织 表达的连接蛋白26(Connexin26)抗原，并能阻遏该连接蛋白26形成的半通道的单链抗体及 表达该抗体的质粒载体，以及所述单链抗体在制备用于治疗连接蛋白26突变引起的耳聋、 皮肤和肿瘤的药物和诊断试剂盒中的应用，本发明还提供利用该抗体制备诊断试剂盒，其 包含所述单克隆抗体作为活性成分。
【背景技术】
[0002] 离子通道间隙连接是一种细胞与细胞之间的连接。它连接细胞的胞质，允许小于 1.8KD的较小分子如离子、代谢产物和第二信使等自由通过 [1'2]。在脊椎动物，由连接蛋白 (Connexin)组成的间隙连接通道介导相邻细胞之间离子、小分子营养物质交换及信号分子 传播。哺乳动物发育早期已有多种连接蛋白表达，不同连接蛋白组成的间隙连接通道具有 不同通透特征，相邻细胞利用间隙连接介导的细胞间通讯或者不依赖间隙连接通道的途径 传递发育信号，调节发育过程中的细胞增殖、迀移和分化。连接蛋白是一个广泛表达于脊椎 动物细胞的蛋白质家族。该家族成员组成的六聚体定位于细胞膜上，形成间隙连接通道或 半通道，介导细胞之间、细胞与细胞外基质之间的物质交换。基因组中编码连接蛋白蛋白家 族的基因组成连接蛋白基因家族 [3]。
[0003] 目前为止在人类基因组中已发现21种连接蛋白基因，小鼠基因组中发现20种连接 蛋白基因[3]，由间隙连接通道和连接蛋白半通道介导的细胞间通讯对许多细胞功能具有重 要的作用，包括调节细胞生长，分化和发育+ 6]。连接蛋白基因的突变与许多人类疾病相关 联，包括心血管异常，周围神经病变，白内障和耳聋。连接蛋白26(Cx26)、连接蛋白30(Cx30) 参与内耳钾离子循环，并且Cx26和Cx30的缺失引起正在发育中的耳蜗中柯蒂氏器极重度耳 聋并伴随细胞死亡 [4'7'8]。〇126和〇130由两个相邻基因（6邛2和6贝6)表达，〇126、〇130在内 耳与非感应细胞连接形成多胞体，两种蛋白在内耳共表达D^DNFBl位于染色体13qll_ql2 [1()]。50%的习语前失聪都与DFNB1有关，地中海人甚至高达79%[1<3'11]。〇126和〇130的缺失突 变对耳蜗螺旋器的器官形成产生深远影响 [12<4]。连接蛋白的点突变会导致连接蛋白形成 的半通道一直处于常开或者常闭状态，导致失聪和皮肤疾病的发生 [15]。特异识别Cx26并恢 复其功能的抗体有望恢复连接蛋白突变导致的失聪和皮肤疾病。
[0004] 近年来单克隆抗体在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，特别是针对表达特异性 抗原的疾病，单克隆抗体与抗原的反应检测可以作为疾病诊断的〃金〃标准，单克隆抗体作 为药物也在自身免疫性疾病和抗肿瘤疾病中发挥重要的作用。
[0005] 与其他常见疾病不同的是，连接蛋白突变导致的疾病由于发病率相对较低，治疗 药物相对较少，另外在耳聋疾病中，由于抗体药物的给药方式存在困难，一直没有针对该靶 点的抗体药物上市。用于临床诊断的试剂盒也没有，所以能够识别、结合连接蛋白的单链抗 体将成为诊治结直肠癌的重要工具。
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【发明内容】
[0022] 本发明的目的是提供一种单链抗体，所述单链抗体可与人源连接蛋白26抗原特异 性结合，从而可以用于制备治疗连接蛋白26突变导致的疾病药物或连接蛋白26相关诊断试 剂盒。
[0023] 为了达到上述目的，本发明提供了一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特 征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv-Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻 链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，Fc指的是恒定区。
[0024] 优选地，所述的恒定区包括CH2恒定区和CH3恒定区。
[0025] 优选地，所述的特异性抑制连接蛋白26的全人抗体特异识别连接蛋白26的胞外区 第41-75氨基酸部分。
[0026] 本发明还提供了一种基因工程抗体，其特征在于，其与上述的特异性抑制连接蛋 白26的全人抗体的单链抗体具有30 %以上的同源序列。
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