一种鸡源唾液乳杆菌的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及菌株领域，具体涉及一种鸡源唾液乳杆菌的应用。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌是人和动物体内肠道正常菌群的一种，其抗病、防病及促生长的作用已有 很多的报道，并且有研究也表明，理想的益生菌菌株最好来自本源动物。乳酸杆菌作为一种 动物体内重要的益生菌，能够调节肠道菌群的平衡，对常见的肠道致病菌具有广谱抗菌作 用；增强机体的免疫力和抵抗力、提高乳品质，改善人类对酸奶乳糖不耐受症状;提高饲料 利用率、促进动物生长性能和肉品质等许多有益的生理功能。另外，抗生素的滥用带来的严 重危害，导致我们需要一种新型的物质来代替抗生素，目前认为，乳酸杆菌是最佳的抗生素 替代品。但不同来源的乳酸菌的生物学特性不同。因此，对乳酸杆菌菌种的分离纯化、研究 其生物学特性是将其进行生产实践应用中的重要环节。目前，国内外对乳杆菌生物特性的 研究多限于乳品、植物来源的乳杆菌，动物源性的乳酸杆菌虽然也被应用，但对其生物特性 的报道相对较少且不系统全面，唾液乳杆菌作为2010年4月22日卫生部办公厅关于印发《可 用于食品的菌种名单》的通知中可食用的菌种之一。它具有很多重要的生理功能，就使得唾 液乳杆菌有望成为优良的食品添加剂及可替代抗生素添加剂的优良益生菌之一。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种鸡源唾液乳杆菌的应用，其命名为Lactobacillus salivarius C_l_3〇
[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0005] Lactobacillus salivarius C-1-3在纤维素降解方面的应用。
[0006] Lactobacillus salivarius C-1-3作为微生态制剂应用于饲料生产中。
[0007] Lactobacillus salivarius C-1-3在动物性食品保藏中的应用。
[0008] 本发明具有以下有益效果：
[0009] 菌株对常见的致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作 用。且该菌株的一个重要的生物学特性是具有纤维素降解能力。经过多次驯化后，该菌株表 现具有较好的抑菌作用及耐酸、耐胆盐、耐高温特性。该菌株的成功分离鉴定及生物学特性 研究为今后其在食品和饲料中的应用奠定了理论和试验基础。
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例中CM-3菌株的PCR电泳图，
[0011] 图中，Μ为2000bp的marker，l为C-1-3菌株16S rDNA基因序列扩增结果；2为空白对 照
[0012] 图2为本发明实施例中C-1-3菌株的系统发育树
[0013] 图3为本发明实施例中C-1-3菌株的生长曲线和耐酸能力。
[0014] 图4为本发明实施例中对不同菌的抑菌圈的大小效果
[0015] 图5为本发明实施例中的耐高温结果
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0017] 实施例1
[0018] 一材料来源：
[0019] 试验动物:本地健康散养溜达鸡，购于沈阳某生态养鸡场。
[0020] 培养基:MRS培养基、SL乳杆菌选择性培养基;LB培养基、麦康凯琼脂培养基、羧甲 基纤维素钠(CMC-Na)固体培养基均购于北京奥博星生物技术有限公司;甘露醇氯化钠琼脂 培养基购于杭州天和微生物试剂有限公司。
[0021 ]试验菌株:鸡源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，均由沈阳农业大学畜牧兽 医临床实验室保存提供。
[0022]二、试验方法 [0023] (1)乳杆菌分离
[0024] 剪断颈部血管快速放血致死，迅速无菌取小肠，置无菌平皿中，移至超净工作台中 剖开，去掉小肠内容物，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，用灭菌载破片刮取小肠黏膜黏 液，然后用灭菌生理盐水进行稀释，依次稀释至1〇_ 2、1〇_3、1〇_4梯度，各稀释度都取0.1ml，在 无菌条件下，用接种环划线种于SL选择性培养基，置于37°C摇床中培养36小时后，接种到 MRS固体培养基中，37 °C培养24小时。
[0025] (2)乳杆菌鉴定
[0026]进行多次划线培养后，挑取形态特征与《伯杰氏细菌鉴定手册》对乳杆菌描述圆 形、表面光滑、乳白色相一致菌落进行革兰氏染色，选取疑似菌株进行生理生化鉴定，包括 生化反应管试验，主要测定项目有:苦杏仁苷、水杨苷、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖等糖 类发酵试验、明胶液化试验、厌氧生长以及葡萄糖酸盐和15°C生长与否等测定试验；菌株 16S rRNA鉴定:利用购于上海生工的细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取细菌的基因组，然 后米用165 11^八通用弓丨物27;1^:5'-&区&区1:七区&1：(3(^区区(31:〇&区-3'；14921':5'-ggttaccttgttactt-3'，以提取的基因组作为模板，进行PCR扩增其16S rRNA基因片段，扩增 体系为30yl:PCR mix 15μ1，通用引物每样ΙμL，基因组ΙμL以及去离子水12yl;PCR反应条件 为：95°C 预变性 5min，94°C 变性 458,50/60°(：退火458,72°(：延伸9〇8,24个循环，72°(：延伸 SmiruPCR完成后，产物经过1%琼脂糖凝胶电泳试验检验结果成功与否。扩增成功后送至上 海生工生物工程有限公司进行生工测序，为了测序的准确性，要求双向测通。测序结果在 NCBI上进行Blast比对，在GenBank中得到几个与分离菌株序列同源性较高的菌株，将这些 菌株作为参考菌株进行同源性分析。使用Clustal X 1.8把这些参考菌株的序列对齐后，使 用DNA star建立菌株的系统进化树，分析菌株的同源性。
[0027] (3)菌株生长曲线的测定
[0028]以1 %的接种量接种到MRS培养基中，置于37°C摇床中培养，分别在0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、14、18、22h取样，测得培养基的pH及采用比浊法，利用分光光度计测得 菌液在OD6QQnm处的吸光度，然后以培养时间为横坐标，以pH和OD6QQnm值为纵坐标，绘制生长 曲线。
[0029] (4)菌株体外抑菌试验
[0030]抑菌试验参考刘冬梅等人用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力。将37°C培养24h的 细菌进行6000rpm离心10min，收集上清液备用;在超净工作台内将事先准备好的鸡源大肠 杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行稀释1 0-2、1 0-3、1 0-4倍，并分别各吸取1 ΟΟμΙ涂布到LB 琼脂固体培养基、麦康凯培养基及甘露醇氯化钠琼脂培养基中，然后用镊子将无菌牛津杯 轻轻放置到涂完指示菌株的平皿中，再吸取160-180μ1的益生菌上清液滴到牛津杯内，注意 不要让上清液溢出牛津杯，最后将平皿放置4 °C冰箱中24h，进行扩散处理。然后放到37°C恒 温箱中培养24h，观察抑菌现象。
[0031 ] (5)纤维素降解试验
[0032]将培养24h的菌株梯度稀释后接种CMC-Na固体培养基上，每个接种点吸取20μ1菌 液，于37 °C的恒温箱中培养4d，取出平板后用lmg/ml的刚果红染色液染色20min，倒掉多余 的刚果红，分别测量菌落直径(d)和降解圈的直径(D)，以降解圈直径和菌落直径的比(D/d) 为指标判定菌株降解纤维素的能力。
[0033] (6)耐酸