一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于大麻脱胶的技术领域;具体涉及一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有 该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 大麻又称为线麻、火麻、汉麻等，属大麻科大麻属一年生草本植物，为我国古老的 纤维作物之一。大麻是重要的纤维作物，其纤维性能优异，具有卫生耐用、抗菌防臭、吸汗透 气、防静电及防紫外线等功能，被广泛应用于服装、汽车、建筑等行业中，是一种环保型的纤 维原料，有巨大的应用前景。新鲜大麻茎需经过脱胶获得纤维后方可进行下一步加工，雨露 怄麻是指大麻收割后，平铺在地上自然环境下经过雨露浸润，一些微生物开始在麻茎上生 长使韧皮部与木质部之间失去粘连而分开，从而释放大麻纤维。但是，天然雨露怄麻耗时较 长，生产效率低，易损伤大麻纤维的质量，这在一定程度上影响了麻类产业的发展。另外，天 然雨露怄麻易受环境及气候的制约，怄麻时间越长气温越低，易出现怄麻不足或无法完成 的情况，致使出麻率低，影响经济效益。因此缩短天然雨露怄麻周期，提高出麻率十分重要。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决目前天然雨露怄麻耗时较长，生产效率低，易损伤大麻纤维质量等 问题;而提供了一株赖氨酸芽孢杆菌及其应用、含有该赖氨酸芽孢杆菌的脱胶助剂及其制 备方法。本发明缩短大麻雨露脱胶周期，价格低廉，起效快，无污染，提高纤维质量，用于加 快大麻雨露脱胶进程、提高大麻纤维质量及产量，促进相关产业的发展。
[0004] 本发明中的一株赖氨酸芽孢杆菌为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.) Z39ayl保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCC No.5618。
[0005] 本发明中细菌Z39ayl，从大庆石化废水中分离获得，革兰氏阴性好氧细菌，菌落圆 形乳白色，表面湿润，中间凸起，四周放射状。能发酵蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和乳糖;柠檬酸盐 试验、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验，显阳性反应。根据《伯杰细菌鉴定手 册》和菌株生理生化生物学特性鉴定为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)。果胶是 大麻胶的主要成份，大麻脱胶主要指果胶的降解，本发明中赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillus sp. )Z39ayl有产果胶酶活性，培养24h果胶酶活性达到170U/mL。加入大 麻脱胶助剂中有助缩短大麻雨露怄麻时间，提高大麻纤维质量。
[0006] 本发明赖氨酸芽孢杆菌(1^8；[11；^3(^11118 8口.）239371的分离方法按以下步骤进 行：
[0007] 一、硫化物降解菌的富集培养
[0008] 取废水10mL，接入200ml初筛培养基中，30°C，培养48h静置30分钟。取上清液40mL， 倒入40ml初筛培养基中，加入似23'9出0(0.248/1)1.21111，以后每隔4811重复上述步骤，使培 养液中Na2S·9H20的含量最后增加至4.8g，然后继续培养三天，静置30min，吸取上清25ml，转 入25ml新鲜的初筛培养基(含4.8g Na2S'9H20)30°C160r/min振荡培养24h，从中取出20ml加 到200ml新鲜的初筛培养基中，30°C160r/min振荡培养24h，得混合菌液。采用碘量法测定培 养液中[S 21，并将[S21降解率高的菌液用于硫化物耐受敏感菌的初步分离。
[0009] 二、硫化物降解菌的初筛及复筛
[0010] 取lmL步骤一获得的混合菌液1 .OmL，注入99.0mL装有玻璃珠的无菌生理盐水中， 30°C振荡30min，并按梯度稀释后取0.1 mL，分别涂布于复筛培养基平板上30°C培养48h，3 个重复。挑取生长快速的不同形态独立菌落，划线纯化，编号培养后进行下一步硫化物降解 能力研究。
[00?1 ]三、硫化物降解菌对硫化钠降解能力的测定
[0012]本实验的负二价硫离子测定采用国家环保总局标准HJ/T 60-2000"水质硫化物 的测定碘量法"，此法适用于含硫化物0.4 mg/L以上的水和废水的测定。取硫化物降解效果 最好的菌株，即为本发明赖氨酸芽孢杆菌Z39ay 1。
[0013]初筛培养基配方（L):蛋白胨15.0g、牛肉膏3.0g、酵母膏3.0g、KH2P〇42.0g、 NaC13 · Og、Na2S2〇3lO · Og、Na2HP〇42 · 0g、Na2S·9H20( 1 · 2~4 · 8g)、KC1 0 · 5g、MgS〇4〇 · 5g。（pH = 7.0,于121°C，0.1 IMpa灭菌30min。固体培养基加琼脂粉10.0 g)
[0014] 复筛培养基配方(L):牛肉膏 2.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl 5.0g、Na2S'9H20 1.6g。（调 pH值7.0到7.2之间，于121°C，0.1 IMpa灭菌30min，固体培养基加琼脂粉10.0 g)对分离得到 的赖氨酸芽孢杆菌Z39ayl进行分子鉴定，按以下步骤进行：
[0015] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，采用以下引物，以菌株DNA为模板进 行PCR扩增，引物序列如下：
[0016] 上游引物F(5-AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3)，
[0017]
[0018] PCR反应条件：94°C变性3min后进入循环；94°C变性45s ; 55°C退火45s，72°C延伸 9〇8,30个循环后72°(3终延伸511^11。
[0019] PCR产物电泳结果如图1所示。测序工作委托上海生工生物工程技术有限公司完 成。
[0020] 赖氨酸芽孢杆菌Z39ayl的16SrDNA序列长度为1439bp测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，BLAST对比结果如表1，构建的系统发育树如图2所示，以确定菌 株的种属关系。
[0021] 同源性分析结果表明，该序列与赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp)内各种 之间有极高的同源性，相似度可达1〇〇%。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定 结果确定赖氨酸芽孢杆菌Z39ayl属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp)。
[0022] 表1 BLAST对比结果
[0023]
[Ο Ο2 4」本友明中颗氨酸芽孢什菌的脫股助刑是由颗氨酸芽孢什菌（L y s i η i b a c i 11 u s sp · )Z39ay 1和束状刺盘孢（Col letotrichum dematium)制成的；所述的束状刺盘孢 (Colletotrichum dematium)购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，菌种编号3.2947，烟草低头病的致病菌，培养温度为25~28°C，菌种历史：中国科 学院微生物研究所-山东益都农科院烟草研究所;具体制备方法是按下述步骤进行的： [0025] 步骤一、挑取权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )Z39ayl接 种到100mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在120r/min、28°C条件下培养16~24h，获得一级种子液 1，将束状刺盘孢(Colletotrichum dematium)接种到100mL液体马铃薯葡萄糖培养基中，在 28°C条件下静止培养4~5d，获得一级种子液2。
[0026]步骤二、将步骤一获得的一级种子液1，按体积百分含量0.5%~1.0%的接种量加 入到牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，于120~140r/min、28°C培养24~48h，得发酵液1;将步骤 一获得的一级种子液2，按体积百分含量1.0 %~2.0 %的接种量加入到发酵培养基中，于28 °C，静止培养4~5d，得发酵液2;
[0027]步骤三、将步骤二获得的发酵液1和发酵液2按体积比1:1~1.5比例混合，得混合 物，向混合物中加入5~8倍(v/v)自来水，混合均匀后即得到大麻雨露脱胶助剂。
[0028]步骤二中制备发酵液2的发酵培养基的配方为:蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，硝酸铵 lg/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾lg/L，加蒸馏水定容至1L，pH为7.0。
[0029] 本发明可采用蔗糖或可溶性淀粉替换发酵液2的发酵培养基中的葡萄糖。
[0030] 步骤三中发酵液1中赖氨酸芽孢杆菌的活菌数为1 〇9~1011个/mL。
[0031]含有该赖氨酸芽孢杆菌(1^8；[11；^30；[11113 8口.）239371的脱胶助剂的使用方法是 将其直接喷施于收割后平铺于地面的大麻茎表面，地面平铺大麻茎的厚度最好低于l0cm， 若高于10cm则需将麻茎翻开喷施以确保底层麻茎可以接种到助剂，施用量为500~800mL/ m20
[0032]东北地区大麻收获期为9~10月份气温偏低。本发明中采用的赖氨