一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于培养链式激活的免疫细胞的试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着现在分子生物学技术和肿瘤免疫学的发展，肿瘤生物治疗已成为继手术、放 疗和化疗后的第四种肿瘤治疗模式，以其安全有效、副作用小及适应症广等优点逐渐被广 大医务工作者、患者及家属接受。肿瘤生物治疗首先采集病人自身的免疫细胞或应用干细 胞，体外培养、激活、扩增，使其具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞的能力，然后回输到病人体 内，直接杀伤肿瘤细胞，同时激发自身免疫功能，达到治疗肿瘤的目的。链式激活的免疫细 胞(Cascade Primed Immune cells,下简称CAPRI细胞)治疗是肿瘤生物治疗的非常重要的 治疗方法，CAPRI细胞疗法的效应细胞包括:NK细胞、NKT细胞、DC细胞、以及CD4+的T辅助细 胞(Th)和CD8+的细胞毒T细胞(CTL)，后两者是主要的杀伤效应细胞，在数量方面，Th和CTL 细胞约占总数的80 %，其余占20 % XAPRI细胞治疗适用于早、中、晚各期肿瘤病人，可应用 于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、脑瘤、黑色素瘤、前列腺癌、头颈部肿瘤、食道癌、肾癌、 肝癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胆囊癌、肉瘤、皮肤癌等二十多种实体肿瘤和血液肿瘤 (T淋巴细胞瘤除外）的治疗。
[0003] 传统的CAPRI细胞培养的方法包括以下几个步骤：
[0004] ①起始的⑶3激活阶段(2-4小时）；
[0005] ②IL2辅助阶段(2-3小时）：加入20单位的IL2/ml;
[0006] ③引发阶段（18-24小时）
[0007] ④扩充阶段(72小时）：细胞因子加入20单位/ml的IL2
[0008] 传统的CAPRI细胞培养的方法存在以下缺陷：
[0009] ①传统的培养方法细胞增殖能力差，最后获CAPRI细胞仅扩增2-3倍，
[0010] ②传统CAPRI细胞培养方法允许采用加入培养液10%胎牛血清；
[0011]③传统CAPRI细胞培养方法加入细胞因子比较单一，且浓度比较低。
[0012] ④传统CAPRI细胞培养方法没有上升到试剂盒高度，故不能产业化生产。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒，从而弥补现有 技术的不足。
[0014] 本发明首先提供一种高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒，包含有如下的组分：
[0015] 1) A号液:所述的A号液为稀释液；
[0016] 2 )B号液:所述的B号液为分离液；
[0017] 3 )C号液:所述的C号液为洗涤液；
[0018] 4)D号液:所述的D号液为培养液；
[0019] 5)E号液为CAPRI体外处理试剂，其中包括I液，为rhIL-2和IFN-γ的混合液；Π 液 为rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ 的混合液，
[0020] 优选的，所述A号液为PH7.2~7.4的PBS释液液。
[0021]优选的，所述B号液为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的分层 液。
[0022] 优选的，所述C号液为质量比0.9%生理盐水。
[0023] 优选的，所述 E 号液中 I 液为 15000-25000U/ml rhIL-2 和 15000-25000U/ml IFN-γ 的培养液。
[0024] 优选的，E号液中 Π 液为27000-35000U/ml rhIL-2、500-600ng/ml rhIL-15、7500-12500U/ml rhIL-18和27000-35000U/ml IFN-γ 的培养液。
[0025] 本发明另一个方面还提供一种用于培养链式激活的免疫细胞的培养液，其组成包 括:氯化钾 28-32mg/ml、氯化 |丐38-4211^/1111、硫酸镁 ll-13mg/ml、氯化钠48-52mg/ml、磷酸二 氢钾28_32mg/ml、碳酸氢|丐1 l_12mg/ml、氨基酸13mg/ml、维生素21_22mg/ml、微量元素 0 · 93mg/ml、白蛋白43_47mg/ml、膜岛素7 · 8-8 · 2mg/ml、亚油酸0 · 38-0 · 42mg/ml、油酸4· 8_ 5 · 2mg/ml、谷胱甘肽2 · 3-2 · 7mg/ml、次黄噪呤0 · 8mg/ml、硫辛酸0 · lmg/ml、丙酮酸 14.5-15 · 5mg/ml、葡萄糖14 · 8_15mg/ml、胸腺啼啶 0 · 12mg/ml。
[0026] 上述的培养液用于制备用于链式激活的免疫细胞培养的试剂盒；
[0027] 本发明还提供上述高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒的使用方法，包括以下步 骤：
[0028] 1)取抗凝外周加入A号液，混勾得混合液；
[0029] 2)在离心管中加入B号液；
[0030] 3)将步骤1)的混合液小心沿管壁加入B号液液面上；
[0031] 4)以2500-3000转/分离心至离心管中由上至下细胞分为四层；
[0032] 5)收集第二层细胞，用C号液混匀后，以1800-2000转/分离心，弃去上清留沉淀重 新用C号液悬浮，洗涤得所需外周血单个核细胞(PBMC);
[0033] 6)将分离的部分外周血单个核细胞用D号液调整细胞浓度2 X106,加入到抗CD3抗 体和Retronectin-TIOOB包被的细胞培养瓶中；
[0034] 7)在37°C、C02浓度为5%细胞培养箱中培养2.5-3.5小时后，加入E号液试剂I，调 整细胞因子rhIL-2和IFN-γ 终浓度分别为750-1250U/ml、750-1250U/ml;
[0035] 8)继续培养2.5-. 35小时后加入步骤5)分离的剩余的PBMC，混匀后继续培养，然后 吸取收集培养的细胞，离心清洗后，悬浮培养在D号液中，加入E号液试剂Π ，调整细胞因子 rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ 浓度分别为450-580U/ml、9-10ng/ml、120-200U/ml和 500-600U/ml；
[0036] 9)继续培养48小时后换液，补加 D号液和E号液，继续培养24小时后倍量换液，继续 培养48小时后收获冻存。
[0037] 本发明的有益效果是:应用本试剂盒可高质量、高数量培养出CAPRI细胞，解决了 现有的CAPRI细胞增殖能力差的问题，采用本方法制备CAPRI细胞数量是传统方法的4倍左 右，并保留了 CAPRI细胞杀伤能力。本试剂盒可规模化生产，运输方便，-80°C低温保存时间 长。
【附图说明】
[0038]图1:传统方法培养CAPRI细胞与本发明技术培养CAPRI细胞数量比较。
【具体实施方式】
[0039]下面通过实施例对本发明进行详细的描述。
[0040] 实施例1
[0041] -种高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒，该试剂盒内容物中包括试剂、耗材两 大部分，其中试剂类包括A号液为稀释液，B号液为分离液，C号液为洗涤液，D号液为培养液， E号液为CAPRI体外处理试剂(包括I液lml四支，为一定浓度rhIL-2和IFN-γ的配制液，试剂 瓶为蓝色帽；Π 液1.5ml八支，为一定浓度rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ的配制液，试 剂瓶为绿色帽）；耗材包括50ml-次性离心管8支，10ml-次性移液管8支，3ml巴氏吸管2支。 [0042]其中：① A号液稀释液为pH7.2~7.4的PBS释液液；
[0043]②B号液分离液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077 ±0.001的分层液； [0044]③C号液洗涤液为0.9 %生理盐水；
[0045]④D号液为培养液，其成分如下：氯化钾28-32mg/ml、氯化钙38-42mg/ml、硫酸镁 1 l_13mg/ml、氯化钠 48_52mg/ml、磷酸二氢钾28_32mg/ml、碳酸氢、氨基酸 13mg/ml、维生素 21_22mg/ml、微量元素 0 · 93mg/ml、白蛋白43_47mg/ml、胰岛素 7 · 8-8 · 2mg/ ml、亚油酸0 · 38-0 · 42mg/ml、油酸4 · 8-5 · 2mg/ml、谷胱甘肽2 · 3-2 · 7mg/ml、次黄噪呤0 · 8mg/ ml、硫辛酸0. lmg/ml、丙酮酸14.5-15.5mg/ml、葡萄糖14.8_15mg/ml、胸腺啼啶0.12mg/ml;
[0046] ⑤E号液试剂I为 15000-25000U/mlrhIL-2和 15000-25000U/ml IFN-γ 的培养液 lml 〇
[0047] ⑥E号液试剂 Π 为27000-35000U/mlrhIL-2、500-600ng/ml rhIL-15、7500-12500U/mlrhIL-18和27000-35000U/ml IFN-γ 的培养液2ml。
[0048] ⑦E号液试剂I、Π 液盛放的包装袋为140 X 100mm的自封袋，透明，密封性好，材料 加厚，不易破损，易消毒，耐受-80 °C低温，运输方便。
[0049]⑧E号液试剂I、Π 液盛放的试剂瓶为1.8ml冻存管，材料为聚丙烯，外旋盖为聚乙 烯，易消毒，耐受-80 °C低温，不易破损。
[0050] 实施例2
[0051 ] 米用本发明技术培养CAPRI细胞(Cascade primed immune cells)与传统方法培 养CAPRI细胞比较。
[0052]传统培养CAPRI细胞步骤:抽取健康志愿者肝