miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及一种miR-126-3p在猪卵巢颗 粒细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 在商品猪肉生产中，母猪的利用年限直接关系到猪场的经济效益。影响母猪利用 年限的因素主要有繁殖障碍、自然环境、品种、营养、疾病等，其中繁殖障碍是导致母猪过早 从猪群中淘汰的最主要原因之一。在母猪繁殖障碍中卵巢的疾病是一个重要诱因。
[0003] 卵巢是哺乳动物重要的生殖腺，是卵泡发育和排卵的重要繁殖器官。卵泡作为卵 巢的基本组成单位，维持着卵子的存在、发育与闭锁。颗粒细胞是卵泡周围扁平或立方状细 胞，其生长与分化在卵泡的发育过程中起着重要的调控作用。雌性哺乳卵巢中仅有少数卵 泡能够发育成熟并排卵，而绝大部分卵泡在发育的各个阶段发生闭锁退化，其重要且直接 原因来自于颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞的凋亡是启动卵泡闭锁的重要机制。
[0004] Micr〇RNAS(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源的具有调控功能的非编码 RNA，其大小长约20~25个核苷酸。它主要通过与靶基因 mRNA的3'端非翻译区（UTR)完全或 不完全配对而降解祀mRNA或抑制mRNA的正常翻译，进而对基因转录后表达进行调控。近年 来，关于哺乳动物卵巢发育的miRNA调控也受到研究者关注，多项研究表明miRNA广泛参与 卵子发生、卵泡发育、闭锁和黄体形成、退化等多个生物学过程。MiRNA还参与一些卵巢疾病 的调控，主要有卵巢癌和卵巢早衰。
[0005] 本发明前期研究中，通过Solexa高通量测序技术，鉴定不同发育时期（3月龄青年 母猪，3胎龄母猪，繁殖障碍母猪)母猪卵巢组织miRNA表达谱，其中miR-126-3p呈显著差异 表达，推测其可能在颗粒细胞中发挥重要调控作用。
[0006] 目前研究中，由于miRNA与靶基因之间的关系是多对多，且动物的一种表型变化， 很难通过一个miRNA和其靶基因调控来控制，基本很难进行活体猪个体水平验证;另外，在 没有较高把握成功的实验情况下，用猪做活体实验的成本太高。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种miR-126_3p在猪卵 巢颗粒细胞中的应用。
[0008] 通过基因工程技术改变该miRNA在颗粒细胞的表达量，进而影响其对颗粒细胞的 凋亡;通过生物信息学软件预测该miRNA靶基因，研究靶基因的功能，来达到该miRNA在猪卵 巢颗粒细胞中应用的目的。
[0009] 本发明的另一目的在于提供所述的miR-126-3p的靶基因。
[0010] 本发明的再一目的在于通过所述的靶基因的应用。
[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0012] 本发明提供一种miR-126-3P在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
[0013] 所述的miR-126-3p的靶基因为PIK3R2和TSC1。
[0014] 所述的靶基因 PIK3R2和TSC1在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
[0015] 在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基因 PIK3R2和TSC1后，能回复由miR-126-3p引起 的细胞功能表型。
[0016]所述的砧1?-126-3口的序列为5/-1^1；1^01^^61^厶1^厶1?〇6-3/;
[0017]本发明的验证结果如下：
[0018] 1、制备miR-126_3p模拟物(mimic)和抑制剂（inhibitor)及检测转染效率。在颗粒 细胞中转染miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhibitor，通过qRT-PCR手段，检测其转染效 率，其中分别转染浓度为50nM的miR-126_3p mimics，以及ΙΟΟηΜ的miR-126_3pinhibitor 后，相对于各自转染的对照组NC，实验组的转染效率分别能达到超表达2000多倍和抑制10 多倍。
[0019] 2、通过转染达上述效率的miR-126_3p mimic和miR-126_3p inhibitor后，检测标 记基因的表达量，以及颗粒细胞凋亡的变化。通过qRT-PCR手段，检测miR-126_3p介导的凋 亡标记基因的表达，发现过表达miR-126_3p(即转染miR-126_3p mimic)抑制了促凋亡标记 基因 Caspase-3的表达，促进了抑凋亡标记基因 BCL2的表达。并通过Annexin V-FITC法检测 miR-126-3p对颗粒细胞凋亡影响，结果显示过表达miR-126-3p抑制颗粒细胞凋亡，而抑制 miR-126_3p促进颗粒细胞凋亡。
[0020] 3、生物信息学软件预测猪miR-126-3p的靶基因，实验证实其靶基因为PIK3R2和 TSC1 JargetScaruMiRandaARNAhybrid 3个生物信息学软件预测miR-126_3p祀基因，运用 K0BAS 2.0软件，对预测的靶基因进行作用通路分析，发现其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激 酶)-AKT (丝氨酸蛋白激酶)通路中关键PIK3R2 (磷酸酯酶基因）、TSC1 (3-磷酸肌醇依赖激 酶)基因，发现PIK3R2和TSC1 3^JTR中含有miR-126-3p序列结合位点，将PIK3R2和TSC1野生 型3'UTR和含有种子序列突变的3'UTR构建到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶报 告分析，发现PIK3R2和TSC1野生型30JTR上游报告基因受到miR-126-3p调控，而突变型不受 miR-126_3p调控。还采用qRT-PCR和We stern blot ting在转录水平和翻译水平验证miR-126-3p调控PIK3R2和TSC1的表达，发现miR-126-3p在转录及翻译水平下调PIK3R2表达，只 在翻译水平下调TSC1表达。
[0021 ] 4、合成 3 对靶基因 PIK3R2 和 TSC1 干扰小片段 / 对照（siRNA-PIK3R2，siRNA-TSCl/ siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手 段，最终筛选干扰效果较好的siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段进行后续实验。
[0022] 5、PIK3R2 和 TSC1 干扰小片段(siRNA-PIK3R2-l 和 siRNA-TSCl-3)转染颗粒细胞，研 究靶基因 PIK3R2和TSC1对猪卵巢颗粒细胞凋亡的应用。通过Annexin V-FITC法检测PIK3R2 和TSC1受到siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段干扰后的颗粒细胞凋亡情况，发现 PIK3R2和TSC1促进颗粒细胞凋亡。
[0023] 6、miR-126-3p靶基因 PIK3R2和TSC1功能回复验证。在颗粒细胞中补充外源干扰的 靶基因 PIK3R2和TSC1后，能否回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。颗粒细胞共转染 miR-126-3p inhibitor/NC和PIK3R2和TSC1 干扰小片段（siRNA-PIK3R2-l和8丨1?祖-了5(：1-3)/siRNA-NC，通过Annexin V-FITC法检测颗粒细胞凋亡情况，发现，miR-126-3p引起的抑 制颗粒细胞凋亡的功能能够被PIK3R2和TSC1回复。
[0024]本发明以miR-126_3p为研究对象，采用了细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细 胞中的应用。关键点和欲保护点：（l)miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的应用；（2)在猪 卵巢颗粒细胞中miR-126-3p与基因 PIK3R2和TSC1靶向关系；（3)基因 PIK3R2和TSC1在猪卵 巢颗粒细胞凋亡中的应用；（4)通过靶基因回复实验，即在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基 因 PIK3R2和TSC1后，验证能否回复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。
[0025]颗粒细胞的凋亡是启动卵泡闭锁的重要机制，本发明第一次证实miR-126_3p、 PIK3R2在猪卵巢颗粒细胞中的应用，以及在猪卵巢颗粒细胞中miR-126-3p与基因 PIK3R2和 TSC1之间的靶向关系;现在的发明关于靶基因功能回复实验仅有少量报道，出现这样的原 因主要是一种表型的变化受到多方面的影响，并且miRNA与靶基因之间的关系是多对多，即 一个miRNA可以靶向多个基因，一个基因也可以是多个miRNA的靶标，所以靶基因的回复实 验很难得到结果，不过，本发明补充外源干扰的PIK3R2和TSC1能够回复由miR-126-3p引起 的细胞功能表型，进一步表明PIK3R2和TSC1在颗粒细胞中是miR-126-3p的重要功能靶标， miR-126-3p可以通过PIK3R2和TSC1来调节颗粒细胞的发育。
[0026]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0027]本发明设计周详，结果可靠。为证明miR-126_3p在颗粒细胞中的应用，本发明除了 研究其自身功能以外还通过靶基因以及靶基因在颗粒细胞中的功能进行研究;本发明还通 过靶基因回复实验，即在颗粒细胞中补充外源干扰的靶基因 PIK3R2和TSC1后，验证能否回 复由miR-126-3p引起的细胞功能表型。
【附图说明】
[0028] 图 1 是qRT-PCR检测miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhi