一种抑制ido1表达的抑制剂及其应用

文档序号:9804494阅读:1967来源:国知局
一种抑制ido1表达的抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学与生物医药技术领域,具体为以吲哚胺_2,3_双加氧酶1 (indoleamin 2,3-dioxygenase 1,ID01,以下简称为ID01)为祀点,抑制ID01表达的抑制剂 及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国社会经济的迅速发展,膳食结构和生活方式的改变,中国人群肥胖患病 率近年来迅速上升,众所周知,肥胖是糖尿病发病的重要危险因素之一,而肥胖症的发生过 程伴随着不同程度的胰岛素抵抗。胰岛素抵抗以破坏代谢器官的胰岛素信号通路为特征, 使肝脏、骨骼肌、脂肪组织对胰岛素敏感性下降,表现为葡萄糖摄取率和利用率下降,机体 代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症,以维持血糖的稳定;当机体血糖调节失衡时 就导致糖尿病的发生,主要症状为多尿、多饮、多食和体重减轻。糖尿病会引发全身多种并 发症的发生,例如心血管疾病、神经系统疾病等。
[0003] 色氨酸是细胞生存的必需氨基酸,犬尿氨酸途径(kynurenine pathway,KP)是色 氨酸代谢的主要途径,并由此产生多种代谢产物。犬尿氨酸途径(kynurenine pathway,KP) 的第一限速酶有吲噪胺双加氧酶1( Indoleamine2,3-Dioxygenase 1,ID01)、吲噪胺双加氧 酶 2(Indoleamine2,3-Dioxygenase 2, ID02)、色氨酸双加氧酶2(Tryptophan2,3-Dioxygenase 2,了002)<^02和ID02主要表达于肝脏、肾脏和肺,而ID01在肝脏以外的其他 组织中都有表达,其中脂肪组织中含量丰富。研究表明犬尿酸代谢产物涉及免疫调节和耐 受机制。ID01缺陷小鼠显示出几乎正常的表型。目前的研究表明犬尿酸代谢途径产生的代 谢产物参与肥胖的发生过程中,而ID01的表达差异直接影响犬尿酸代谢途径,这表明ID01 可能成为一个合适的治疗目标,通过抑制ID01的表达,达到预防和治疗肥胖及糖尿病等相 关代谢疾病的目的。由于代谢性疾病的病因包括遗传的和后天的多种因素,所使用的药物 多针对不同的病因,及其繁多,因此确立一个针对多种病因、最佳的、副作用最少的治疗目 标是一个巨大的挑战。
[0004] RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因 沉默现象,其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内 源性mRNA编码区同源的双链RNA时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默(Fire A,Xu S, Montgomery M,Kostas S, Driver S,Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature,1998391 (6669): 806-11) ANAi机制普遍存在于动植物,尤其是低等生物中。因此被认为是进化上相 对保守的基因表达调控机制。研究表明,RNAi机制可能是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的 防御机制而存在的。
[0005] RNAi在基因沉默方面具有高效性和简单性,19个核苷酸的双链RNA几乎可以完全 抑制基因的表达,而且还具有很高的特异性,与靶mRNA之间一个碱基的错配都会显著削弱 基因沉默的效果,所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于标靶基因(或疾病基 因)的抑制剂,因此RNAi模拟了药物的作用,在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重 要工具。同时,那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为 RNAi药物。
[0006] 基因敲除(knock-out)小鼠是一种遗传工程技术下利用基因剔除技术所做出的一 或多个特定基因被剔除的小鼠。此技术为用来观察并研究活体内基因表现的工具之一。此 外,更可借由基因剔除后对小鼠所产生的变化,精确地了解人类先天基因缺损所造成疾病 的致病机制,也是此技术的重大优点之一。
[0007] 我们利用RNA干扰技术及基因敲除小鼠,了解ID01基因沉默或敲除对动物和人类 代谢功能障碍所起的作用,从而确定ID01是否可以成为一种全新的预防和治疗肥胖及胰岛 素抵抗等相关代谢性疾病靶点。对发明一个针对多种病因、最佳的、副作用最少的治疗药物 或制剂有着极其重要的意义。

【发明内容】

[0008] 为了解决以上问题,本发明的目的在于提供一种siRNA,该siRNA可靶向抑制ID01 的表达。
[0009] 为实现上述目的,本发明采用的技术方案:
[0010] 一种抑制ID01表达的抑制剂,所述抑制ID01表达的抑制剂为SiRNA,其特征在于: 所述8丨1?祖为靶向1001基因的双链1?熟分子正义链 :5/-600^了6六0六了六06六6六六0六1'-3/,反义
[0011] 优选地,所述双链RNA分子的3'末端还有两个悬挂碱基,以增加 siRNA活性,能够导 入哺乳动物细胞,抑制IDO 1的表达。
[0012] 优选地,所述双链RNA分子为正义链:57 -GCCCATGACATACGAGAACATtt-3',反义链: 5/_ATGTTCTCGTATGTCATGGGCtt_ 3/。
[0013] 优选地,所述化学修饰为磷酸骨架修饰,包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部分 修饰或用其他化学键取代,用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子,提高了 siRNA抗核 酸酶的能力,增加它的稳定性。
[0014] 化学修饰为核糖修饰,包括对这些SiRNA分子核酸戊糖2位上的0H作的化学修饰和 改变,RNA酶不易识别修饰过的s iRNA,从而增加了 s iRNA的稳定性。
[0015] 化学修饰还包括对siRNA分子碱基的修饰,siRNA与mRNA通过碱基互补形成氢键, 发挥RNAi的作用,因此对碱基进行修饰,提高碱基的相互作用。
[0016] 还包括亲脂性基团修饰,加强siRNA的亲脂性,增加其透过细胞膜的能力;这些修 饰能够增加 siRNA的稳定性,同时增强其生物学活性,能够顺利导入哺乳动物细胞,抑制目 的基因的表达。
[0017 ]本发明采用s i RNA设计法则,设计并筛选出一段能够抑制IDO 1基因表达的s i RNA序 列,利用基因敲除技术得到了ID01缺陷小鼠用于本发明,通过高脂饮食诱导,进行体重增长 测试,葡萄糖耐量实验以及胰岛素敏感实验,结果表明与野生型小鼠对比,ID01基因敲除小 鼠体重低于野生型小鼠,其葡萄糖的耐受性高于野生型小鼠,其胰岛素敏感性高于野生小 鼠,并且ID01基因敲除能够缓解高脂饮食诱导的内脏脂肪堆积。并通过转染实验将抑制剂 siRNA转入前体脂肪细胞3T3L1细胞中,与对照组相比,IDOlsiRNA以剂量依赖的方式抑制 ID01的表达,siRNA沉默ID01可降低3T3L1分化为脂肪细胞的效率,这为预防和治疗肥胖及 胰岛素抵抗等相关代谢性疾病提供了理论依据和临床基础。
[0018] 本发明涉及ID01抑制剂在制备预防和治疗肥胖及糖尿病相关代谢性疾病药物中 的应用。以ID01为靶基因,设计可抑制ID01表达的双链siRNA,通过化学方法合成。经过化学 修饰或亲脂性基团修饰后直接注射入哺乳动物的体内,通过RNA干扰的方法使I DO 1基因沉 默来预防或治疗肥胖及糖尿病。
[0019] 本发明的有益效果是:本发明的优越性在于运用RNA干扰技术及相关技术探明了 ID01基因沉默能够治疗和预防肥胖及胰岛素抵抗,从而确定ID01可以成为一种全新的预防 和治疗肥胖及糖尿病等相关代谢性疾病的靶点,对发明一个针对多种病因、最佳的、副作用 最少的治疗药物或制剂有着极其重要的意义,为制备相关药物或制剂提供了新的选择,有 着广阔的应用前景。
【附图说明】
[0020] 图1:1 DO 1基因敲除小鼠附睾脂肪中I DO 1表达缺失。
[0021] WT代表野生型小鼠 (n = 4),Ido-Λ代表1D01基因敲除鼠 (n = 4)。
[0022]图2: ID01缺陷小鼠改善高脂饮食诱导下的小鼠肥胖和胰岛素抵抗。2A,60%高脂 饮食和普通饮食分别喂养野生型和ID01缺陷小鼠3个月,HF WT代表高脂野生组,HF K0代表 高脂敲除组,ND WT代表普通野生组,ND K0代表普通敲除组;2B,记录高脂饮食诱导3个月小 鼠体重增长图;2C,葡萄糖耐量实验的血糖值;2D,胰岛素敏感实验的血糖值。
[0023]图3:ID01敲除能够缓解高脂饮食诱导的内脏脂肪堆积。
[0024] 3A,高脂饮食诱导12周,四组小鼠的附睾脂肪组织的大体图;B,附睾脂肪组织的绝 对重量;3C,附睾脂肪石蜡切片HE染色(左),附睾脂肪中脂肪细胞的面积统计(右)Xtl, Control;林,p〈0.001。
[0025]图4:ID01siRNA剂量依赖性抑制前体
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