Dcstamp基因及其应用
【技术领域】
[00011本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地，涉及一种DCSTAMP基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是含有8个RNA基因组片段的负链RNA病毒。高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽 类为主的烈性传染病。
[0003] 水禽包括家鸭是流感病毒的天然宿主，所有16种HA和9种NA的不同组合的亚型都 能在水禽中分离。流感病毒对水禽一直保持着低致病力的特征，水禽感染病毒并不发病，但 可以向外界排毒。某些对水禽致病力低的毒株，对鸡或其他宿主则表现为高致病性。然而， 随着流感病毒的不断进化，水禽与流感病毒的平衡状态被打破。如2002年首次报道在香港 出现致死水禽的H5N1亚型毒株，2005年青海湖大规模爆发H5N1亚型流感病毒致死候鸟事件 等。在人群中流行的新毒株出现有多种方式:禽流感病毒或其他流感病毒与人流感病毒发 生基因重排产生感染人的流行毒株、禽流感病毒在猪体内适应后产生的流行株、禽流感病 毒传播到人产生流行毒株以及人流感病毒老毒株时隔数年后又重新流行，此外，还有人流 感病毒本身的抗原漂移等。
[0004]总之，A型流感病毒的最大特点是宿主广泛，亚型众多，变异形式多样，发病突然， 流行性、致病性强，易诱发严重并发症，危害巨大。因此，科学家们在研究流感病毒的变异、 进化、流行与分布规律，提高防控流感能力的同时，也致力于鉴定新的抗流感病毒的免疫基 因，解析宿主影响流感病毒感染性、致病力以及免疫应答的分子机理研究，以提高宿主的抗 病性能及促进防控流感病毒新手段的开发。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种与抵抗流感病毒相关的新基因，以及提供该基因在抗流 感病毒中的应用。
[0006] 本发明的发明人在研究中发现水禽包括家鸭是H5N1亚型流感病毒的储存宿主，早 期病毒不致死水禽，感染病毒的水禽自身也不表现出明显的临床症状，随着病毒的不断进 化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。因此发明人通过研究比对感染两种亚型H5N1毒株 的北京鸭的差异基因表达寻找抗性或易感相关的基因。从而发现并提供了一种鸭的 DCSTAMP基因，所述鸭DCSTAMP基因具有：
[0007] a)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或
[0008] b)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得 的具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。
[0009]本发明还提供了所述的鸭DCSTAMP基因所编码的氨基酸序列。
[0010]本发明还提供了含有所述鸭DCSTAMP基因的载体。
[0011] 优选的，所述载体为导入鸭DCSTAMP基因 CDS序列后获得的PiggyBac-DCSTAMP载 体。
[0012] 本发明还提供了含有所述的鸭DCSTAMP基因的转基因细胞。
[0013] 所述转基因细胞可以为禽类细胞或哺乳动物细胞。
[0014] 优选的，所述转基因细胞为鸡胚成纤维永生化细胞系DF1。
[0015 ]本发明还提供了所述的鸭DCSTAMP基因在影响流感病毒复制中的应用。
[0016] 可选的，所述流感病毒包括H5N1型AIV病毒，例如可以为低致病力的毒株GS/65(A/ 区〇〇86/!1油6；[/65/05)和高致病力的毒株01(/49(八/(11101<:/!1油6；[/49/05)。
[0017] 可选的，所述应用包括通过鸭DCSTAMP基因在细胞中的过表达来抑制AIV病毒在细 胞中的复制，以及在敲除DCSTAMP的细胞中AIV病毒的复制显著增加。
[0018] 本发明还提供了一种转基因动物的构建方法，所述方法包括在动物细胞转入本发 明所述的鸭DCSTAMP基因。
[0019] 本发明所述鸭DCSTAMP基因可用于制备抗流感病毒的转基因动物，此外，敲除 DCSTAMP基因的细胞系可以作为AIV等病毒疫苗生产的工具细胞。
[0020] 本发明所提供的DCSTAMP基因可用于抑制流感病毒，特别是可以显著抑制AIV病毒 的复制，因此可以针对鸭DCSTAMP基因进行深入的功能研究，从而确定其抗AIV病毒的关键 蛋白结构域或氨基酸。利用转基因技术等基因编辑方法，获得可诱导性高表达DCSTAMP基因 的转基因畜禽，培育出抗AIV等多种类型病毒的转基因农业动物优良品种。
【附图说明】
[0021 ]图1为本发明实施例1中利用转录组数据分析得到的鸭DCSTAMP基因 mRNA序列。 [0022]图2为本发明实施例3中所述载体PiggyBac的图谱，其中X gene为DCSTAMP。
[0023]图3为本发明实施例4、5中瞬时转染DCSTAMP以及阴性对照质粒24h后DF1细胞的镜 下观察结果。
[0024]图4为本发明实施例4、5中瞬时转染DCSTAMP以及阴性对照质粒48h后，收取细胞总 蛋白后对DCSTAMP基因的过表达效果的Western blot验证。
[0025] 图5为本发明实施例4、5中在DF1细胞中过表达DCSTAMP基因，抑制实施例6中流感 病毒DK/49 (左)和GS/65 (右）的复制。
[0026] 图6为本发明实施例4、5中DF1细胞感染流感病毒AIV(DK/49)48h后，内源DCSTAMP 基因 mRNA的表达变化，以GAPDH基因作为内参。
[0027] 图7为本发明实施例4、5中细胞过表达DCSTAMP基因前后，感染流感病毒AIV(DK/ 49)后，病毒不同形式RNA的相对表达变化，以GAPDH基因作为内参。
【具体实施方式】
[0028]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0029]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0030]若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册 (New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)，或按照制造厂商说明书建议 的条件。
[0031] 实施例1
[0032]利用分析转录组数据发现新的抗AIV感染的基因 DCSTAMP。
[0033] 水禽包括家鸭是H5N1亚型流感病毒的天然宿主，其感染部分H5N1亚型病毒后，不 表现出明显的临床症状。随着病毒的不断进化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。本研究 选取两种H5N1亚型毒株（即高致病性的A/duck/Hubei/49/05(DK/49)及低致病性的A/ g〇〇Se/Hubei/65/05(GS/65)H5Nl病毒），感染4周龄绍兴麻鸭。通过高通量测序的方法，分别 构建感染DK/49或GS/65H5N1流感病毒后1天、2天和3天鸭的以及对照组鸭的脾脏、脑和肺组 织基因表达图谱，鉴定参与机体抗流感病毒相关的免疫基因，为禽流感的治疗和预防提供 新办法。
[0034] 前期用DK/49或GS/65H5N1病毒感染4周龄绍兴麻鸭，分别在感染AIV后1、2和3天 后，取脾脏、脑和肺组织样，提取总RNA，建库进行高通量测序，通过生物信息学分析。分析发 现:与对照组相比较，无论是在感染DK/49或GS/65H5N1病毒后1、2和3天的脾脏、脑和肺组织 中，DCSTAMP的表达量均极显著升高（如图1所示，分别在两株H5N1毒株(A/duck/Hubei/49/ 05，DK/49，高致病)和(A/goose/Hubei/65/05，GS/65，低致病），感染4周龄绍兴鸭后的第1、 第2和第3天脾脏、肺和脑组织中的表达模式；横坐标代表时间点，纵坐标代表相对表达 量。）。
[0035] 实施例2
[0036]利用分子生物学实验方法获得鸭DCSTAMP基因全长编码区序列
[0037]参照Ensemble网站上的鸭基因组参考序列，并根据转录组拼接序列，设计鸭 DCSTAMP基因全长⑶S区克隆引物TF/TR，序列如下：
[0038] TF:5，-ATGCAAGCAC TTGTCTCAAC AGCCC-3,，
[0039] TR:5，-TCCAAAACAC TGCTGACCAT TAGCC-3，。
[0040] 以鸭脾脏组织cDNA为模板，利用NEB公司的Q5高保真聚合酶进行PCR扩增，扩增产 物经胶回收后连接到T载体上进行测序。序列比对分析后发现：鸭DCSTAMP基因全长编码区 为 1431bp(SEQ ID N0.1)，共编码476个氨基酸（SEQ ID N0.2)。
[0041] 本发明人成功克隆得到鸭DCSTAMP基因全长编码区序列。
[0042] 实施例3
[0043]利用细胞学实验方法在细胞中瞬时过表达DCSTAMP基因 [0044] 1、鸭DCSTAMP基因过表达载体的构建
[0045] 根据鸭DCSTAMP基因编码区序列，设计其真核表达载体引物eTF/eTR，上、下游引物 都是分别引入Mlu I和Pme I酶切位点（下划线标注）；此外，上游引物在起始密码子ATG之前 引入kozak(粗体标注)序列，在目的基因 C末端引入flag标签(粗体标注）。引物序列如下：
[0046] eTF：
[0047] 5 '-C