1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中1，2, 4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1，2, 4-丁三醇 中的应用。
【背景技术】
[0002] 从自然资源中发掘新酶或人工设计新酶是合成生物技术的基础，自然界中的生物 多样性和丰富的基因资源为发掘具有心功能的酶提供了广阔的来源，通过挖掘新酶已经使 人类能够合成很多自然界中不存在的有用化学品。
[0003] 1，2, 4-丁三醇是一种在军工和民用上都具有重要用途的化学品。它是一种手性多 羟基醇，作为重要的有机合成中间体，可用于制备生物活性剂、医药用缓释剂、卷烟添加剂、 抗菌剂、彩色显影剂等。其硝化产物1，2, 4-丁三醇三硝酸酯，可作为飞机、火箭、导弹等军 事武器的推进剂，较硝化甘油具有冲击敏感性低、热稳定性好等优点。目前，1，2, 4- 丁三醇 的工业化生产主要依靠化学合成法，缺点是副产物多，产物产率低，对环境有危害等，由此 也限制了 1，2, 4- 丁三醇及1，2, 4- 丁三醇三硝酸酯的商业前景。
[0004] 自然界不存在1，2, 4-丁三醇的天然生物合成途径，所以生物法生产1，2, 4-丁三 醇的研究进展比较缓慢。2003年，Wei Niu等使用双微生物工艺，以D-木糖和L-阿拉伯糖为 碳源，建立了 1，2, 4- 丁三醇的生物合成途径（Niu, W.，Molefe, Μ· N.，Frost, J. W. Microbial synthesis of the energetic material precursor 1, 2, 4-butanetriol. Journal of the American Chemical Society. 2003, 125 (43): 12998-12999·)。随后进一步改良该方法，建 立了在大肠杆菌利用D-木糖合成1，2, 4- 丁三醇的生物合成系统（J *W ·佛罗斯特，W ·牛， D-1，2, 4- 丁三醇的微生物合成，中国专利【申请号】200780032753. 9,申请日：2007年7月19 日）。这些研究中，从木糖转化为1，2, 4-丁三醇的生物反应途径主要包括脱氢、脱水、脱羧、 加氢4步反应，其中，第二步（脱水）和第四步（加氢）反应所需的酶在大肠杆菌中天然 存在，而第一步和第三步反应的酶需外源导入。前人研究中催化第一步脱氢反应的酶为木 糖脱氢酶（XDH)，来源于新月柄杆菌（Caulobacter crescentus);催化第三步反应的酶为 2-酮酸脱羧酶，是来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)的苯甲酰甲酸脱羧酶（MDLC)。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何提高生物法生产1，2, 4-丁三醇的产量和得 率。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供1，2, 4-丁三醇相关蛋白或其编码基因在 制备1，2, 4-丁三醇中的应用。
[0007] 本发明所提供的1，2, 4-丁三醇相关蛋白在制备1，2, 4-丁三醇中的应用中，所述 1，2,4-丁三醇相关蛋白的名称为851^，所述851^，是如下81)或82)的蛋白质：
[0008] B1)氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白质；
[0009] B2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。
[0010] 其中，SEQ ID No. 1由548个氨基酸残基组成。
[0011] 上述B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 1所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0012] 上述应用中，所述BSRP的基因为下述Bll)-B13)中的任一种DNA分子：
[0013] B11)编码序列是SEQ ID No. 2的第71-1717位核苷酸所示的cDNA分子或基因组 DNA ；
[0014] B12)在严格条件下与B11)限定的DNA分子杂交且编码所述BSRP的cDNA分子或 基因组DNA ;
[0015] 813)与811)或价2)限定的0嫩分子具有75%以上的同一性且编码所述831^的 cDNA分子或基因组DNA。
[0016] 其中，SEQ ID No. 2由1726个核苷酸组成，SEQ ID No. 2的第71-1717位核苷酸编 码SEQ ID No. 1所示的氨基酸。
[0017] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码所述BSRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发 明分离得到的所述BSRP的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述BSRP， 均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0018] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"75%以上的同一性" 包括与本发明的编码BSRP的核苷酸序列具有75 %或更高，或85 %或更高，或90 %或更高， 或95 %或更高，或97 %或更高，或99 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0019] 上述应用中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗 膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 15min〇
[0020] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种构建用于生产1，2, 4- 丁三醇的重组 细胞的方法。
[0021] 本发明所提供的构建用于生产1，2, 4-丁三醇的重组细胞的方法，包括对受体细 胞进行A3)、A5)、A6)和A7)的改造得到重组细胞的步骤：
[0022] A3)将所述受体细胞的木糖异构酶基因敲除；
[0023] A5)向所述受体细胞中导入木糖脱氢酶基因；
[0024] A6)向所述受体细胞中导入醇脱氢酶基因；
[0025] A7)向所述受体细胞中导入1，2, 4- 丁三醇相关蛋白基因；
[0026] 所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
[0027] 上述方法中，所述方法还包括对所述受体细胞进行Al)、A2)和A4)中任一种、任两 种或三种的改造得到重组细胞的步骤：
[0028] A1)将所述受体细胞的2-酮酸脱氢酶基因敲除；
[0029] A2)将所述受体细胞的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因敲除；
[0030] A4)将所述受体细胞的木酮糖激酶基因敲除；
[0031] 上述方法中，所述微生物细胞可来自埃希氏菌属（Escherichia)，如大肠杆菌，具 体可为BL21 (DE3)、大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BW25113的突变体等。
[0032] 由于在所述大肠杆菌中存在如图8所示的代谢途径，所以，上述方法中所述重组 细胞可为对受体细胞进行所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞， 所述重组细胞还可为对受体细胞进行所述所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、 所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述A1)、所述A3)、所述 A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述A2)、所述A3)、所 述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A3)、所 述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述 A1)、所述A2)、所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细 胞进行所述所述A1)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组 细胞，或对受体细胞进行所述所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7) 的改造得到的重组细胞。
[0033] 上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因为2-酮酸脱氢酶基因 ycdW和yiaE ;所述 3_脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因为3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因 yagE和 yjhH ;所述木糖异构酶基因为木糖异构酶基因 xylA ;所述木酮糖激酶基因为木酮糖激酶基 因 xylB ;所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因 adhP ;所述木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因 xdh〇
[0034] 上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因 yiaE编码下述HI)或H2)的蛋白质：
[0035] H1)氨基酸序列为SEQ ID No. 3的蛋白质；
[0036] H2)在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由H1)衍生的蛋白质；
[0037] 所述2-酮酸脱氢酶基因 ycdW编码下述II)或12)的蛋白质：
[0038] II)氨基酸序列为SEQ ID No. 5的蛋白质；
[0039] 12)在SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由II)衍生的蛋白质；
[0040] 所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因 yagE编码下述J1)或J2)的蛋白 质：
[0041] J1)氨基酸序列为SEQ ID No. 7的蛋白质；
[0042] J2)在SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由J1)衍生的蛋白 质；
[0043] 所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因 yjhH编码下述K1)或K2)的蛋白 质：
[0044] K1)氨基酸序列为SEQ ID No. 9的蛋白质；
[0045] K2)在SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由K1)衍生的蛋白 质；
[0046] 所述木糖脱氢酶基因 xdh编码下述L1)或L2)的蛋白质：
[0047] L1)氨基酸序列为SEQ ID No. 11的蛋白质；
[0048] L2)在SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有木糖脱氢酶功能的由L1)衍生的蛋白质；
[0049] 所述醇脱氢酶基因 adhP编码下述Ml)或M2)的蛋白质：
[0050] Ml)氨基酸序列为SEQ ID No. 13的蛋白质；
[0051] M2)在SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有醇脱氢酶功能的由Ml)衍生的蛋白质；
[0052] 所述木糖异构酶基因 xylA编码下述01)或02)的蛋白质：
[0053] 01)氨基酸序列为SEQ ID No. 17的蛋白质；
[0054] 02)在SEQ ID No. 17所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有木糖异构酶功能的由01)衍生的蛋白质；
[0055] 所述木酮糖激酶基因 xylB编码下述P1)或P2)的蛋白质：
[0056] P1)氨基酸序列为SEQ ID No. 19的蛋白质；
[0057] P2)在SEQ ID No. 19所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有木酮糖激酶功能的由P1)衍生的蛋白质。
[0058] 上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基