一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建、单抗及试剂盒的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及免疫学测定分析领域，特别涉及一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建、单抗及试剂盒的制备方法。
【背景技术】
[0002]胃泌素释放肽前体(ProGRP)是小细胞肺癌的一个非常可靠的指标，具有很好的灵敏度和特异性。肺癌早期无症状和症状轻微，2/3的患者在发现时已处于扩散阶段，五年存活率小于5%，如能早期发现，通过手术治疗，五年存活率高达70% — 80% ,ProGRP在小细胞肺癌早期就有可测浓度的分泌，所以该标志物毫无疑问能用于高危患者的筛查。
[0003]ProGRP的释放不仅更多见于小细胞肺癌的癌细胞，而且还发现其在肿瘤和器官的特异性方面优于其他生物标志物。ProGRP具有强大的鉴别诊断能力是因为良性病变时ProGRP的产生量很少，其他癌症(非小细胞癌症和非神经内分泌癌症)中也没有ProGRP产生，或者产生量很少。ProGRP在预测复发及转移可能性方面的表现要优于NSE，并能取代NSE对小细胞肺癌的治疗进行监测。
[0004]但是，单纯大肠表达的ProGRP免疫原是半抗原，免疫原性很差，后期尝试过将重组表达的ProGRP化学偶联大分子载体蛋白BSA或者KLH结构免疫活性也是很差。
[0005]人体正常状态下少量表达HSP，其含量仅占总蛋白5%?10%，而且受自身免疫调节网络作用，不会引起免疫应答反应。当病原体感染机体时，病原体相对抗体及其机体针对病原体均可合成HSP，二者HSP同源性高于50%，由此构成HSP在不同个体中介导抗感染免疫或自身免疫反应的基础。
[0006]热激蛋白融合表达蛋白是一种能增强所融合表达的蛋白免疫效果的一种表达方法，但这种方法存在筛选抗体时用到的抗原需要另外制备的问题，且往往需要额外的制备纯的蛋白来进行抗体筛选;而未采用融合表达的方法制备出的抗体效价往往不高，需要很长时间才能筛选出较高效价的单抗。
【发明内容】
[0007]针对现有技术中的上述问题，本发明的目的是提供一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建，能够通过一次克隆表达，制备出高免疫原性的ProGRP和HSPA6融合蛋白，ProGRP-HSPA6融合蛋白既可以作为免疫原，也可以很方便的通过一步酶切制备出不含表达标签的纯ProGRP用于单抗鉴定及抗体筛选的蛋白抗原。
[0008]本发明的另一目的是提供一种利用上述胃泌素释放肽前体蛋白表达载体制备单抗的方法，利用ProGRP-HSPA6融合蛋白做为免疫原提高了免疫原性，增加了免疫效果，很大程度的提高了抗体制备和筛选效率。
[0009]本发明的另一目的是提供一种胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，试剂盒的制备周期短，所述试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中胃泌素释放肽前体(ProGRP)水平，可以进行双抗体夹心法的磁粒子化学发光检测样本。
[0010]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建，包括如下步骤:
[0011 ] 在HSPA6蛋白基因上引入肠激酶酶切位点序列，通过酶切位点将带肠激酶酶切位点的HSPA6克隆到载体上，得到中间表达载体;再通过酶切位点将ProGRP目的基因克隆到所述中间表达载体上，以构建得到ProGRP-HSPA6目的表达载体。
[0012]作为进一步的优选，通过BamHI/Notl双酶切位点将带肠激酶酶切位点的HSPA6克隆到载体上。
[0013]作为进一步的优选，通过Nadl/BamHI双酶切位点将ProGRP目的基因克隆到所述中间表达载体上。
[0014]作为进一步的优选，所述中间表达载体为PET-28a_HSPA6表达载体，所述目的表达载体为PET-28a-ProGRP-HSPA6表达载体。
[0015]作为进一步的优选，根据uniprot蛋白数据库的基因序列合成ProGRP基因片段。
[0016]利用上述胃泌素释放肽前体蛋白表达载体制备单抗的方法，包括如下步骤:
[0017]I)将ProGRP_HSPA6表达载体导入宿主；
[0018]2)采用IPTG诱导表达融合蛋白；
[0019]3)镍离子柱纯化得高纯度蛋白做为免疫原；
[0020]4)免疫动物；
[0021]5)取所述免疫动物的细胞制备融合细胞;筛选分泌单抗的杂交瘤细胞系，建立单抗细胞株，并制备单抗腹水。
[0022]作为进一步的优选，还包括步骤6)抗体的筛选:利用肠激酶切掉HSPA6+ProGRP融合蛋白的HSPA6标签部分，得到纯的ProGRP来筛选所述单克隆抗体。
[0023]作为进一步的优选，步骤2)中，将测序正确的重组体PET-28a-ProGRP-HSPA6转入至BL21菌株中，经37°C培养至OD值达到0.55?1.0，在22°(:下以0.1_01/1 IPTG诱导2h，收集菌体，取少量的菌体制成SDS-PAGE样品；将收集的菌体用PBS将菌株悬浮起来，加PMSF和DTT，然后加溶菌酶30min，期间要随时调pH至8.0，最后加完Triton离心，去沉淀，取少量上清和沉淀制成SDS-PAGE样品，进行SDS-PAGE分析。
[0024]作为进一步的优选，步骤3)中，将表达菌体重悬于60ml Bufer B(0.05mol/LNa3P04，0.3mol/L NaCl，0.0lmol/L imidazole ,pH 8.0)，进行超声破碎细菌，然后离心取上清，上样由Bufer B平衡过的N1-1DA亲和层析柱，再用Buf er C(0.05mol/L Na3P04 ,
0.3mol/L NaCl，0.05mol/L imidazole，pH8.0)洗层析柱去除杂蛋白，最后通过Buffer D(0.05mol/L Na3P04，0.3mol/L NaCl，0.25mol/L imidazole,pH 8.0)洗脱，收集目的蛋白洗脱峰;SDS-PAGE检验蛋白纯度，考马斯亮蓝染色结果用Quantity one进行灰度分析，估算目的蛋白纯度;Western blot对蛋白进行鉴定。
[0025]作为进一步的优选，步骤4)中，免疫前先尾静脉取血，作阴性对照。用ProGRP-HSPA6免疫6周龄BALB/C小鼠6只，背部皮下多点注射，免疫剂量为100只(即0.2mL/只);首次免疫，取无菌PBS溶解的ProGRP-HSPA6，与等体积的弗氏完全佐剂混合，漩涡混合仪上充分乳化;加强免疫，弗氏佐剂改用弗氏不完全佐剂，其余同前;共免5次，每次间隔2周，每次免疫后第10天断尾采血，最后一次免疫后第10天眼眶采血，4°C过夜析出血清，3000r/min下离心lOmin，取上清，一部分直接于4°C冰箱内保存，一部分-20°C下保存备用，收集的抗血清用硫酸胺法进行纯化。
[0026]作为进一步的优选，步骤5)中，蛋白纯化产物免疫BAIB/c小鼠，取鼠脾脏与Sp2/0细胞混合;用ELISA方法筛选分泌单抗的杂交瘤细胞系，建立单抗细胞株，并制备单抗腹水。
[0027]作为进一步的优选，步骤6)中，纯化的融合蛋白在50mMTris，pH值为8.5的缓冲液中透析过夜，置换缓冲体系为EK切割bufer(50mmol/L Tris-HCI，pH8.5)，按EK酶与蛋白1:1000的质量比加入EK酶，4°C低速摇床(60r/min)切割12h左右；切割后用Bufer B稀释后镍离子柱纯化，分别收集穿透、10%B和100%B的蛋白，17.5%SDS-PAGE电泳进行鉴定;取穿透蛋白洗脱液，浓缩后包被于空白的酶标板上，用于抗体的ELISA效价鉴定;抗体效价测定:倍比稀释单抗腹水，进行ELISA检测，同时用Sp2/o细胞腹水作阴性对照。
[0028]—种胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，包括如下步骤:
[0029]吖啶酯标记一所述Pro-GRP单克隆抗体；
[°03°]将另一所述Pro-GRP单克隆抗体偶联上磁粒子；
[0031 ]将样本、磁粒子偶联的Pro-GRP单克隆抗体及吖啶酯标记的Pro-GRP单克隆抗体进行反应后，形成抗体一抗原一抗体夹心复合体，制作成化学发光试剂盒用于样本检测。
[0032]作为进一步的优选，吖啶酯标记所述Pro-GRP单克隆抗体具体步骤如下:取一定量Pro-GRP单克隆抗体，采用0.05mol/L pH 9.5CB调整浓度为lmg/mL;按抗体:吖啶酯=I: 10?20摩尔比加入已活化吖啶酯，室温反应0.5?1.0h;将反应液移至透析袋(截留分子量8000?12000)，采用0.05mol/L pH 9.5CB透析24h，加人等量甘油，放置?20°C以下保存。
[0033]作为进一步的优选，将所述抗体偶联磁粒子具体步骤如下:将磁微粒或磁粒子用50mmol/L NaC03_NaHC03p